数据分析文献阅读_测序深度和覆盖度
基因组测序实验报告
基因组测序实验报告一、实验背景随着生命科学的快速发展，基因组测序技术已经成为研究生物遗传信息的重要手段。
通过对基因组的测序，可以深入了解生物的基因组成、遗传变异、基因功能以及与疾病的关系等。
本次实验旨在对_____样本进行基因组测序，以获取其详细的遗传信息。
二、实验目的1、掌握基因组测序的基本原理和实验流程。
2、对_____样本进行全基因组测序，获得高质量的测序数据。
3、分析测序数据，查找可能存在的基因突变和遗传变异。
三、实验材料与方法（一）实验材料1、样本来源：＿____2、试剂与仪器：DNA 提取试剂盒测序试剂盒测序仪离心机移液器等（二）实验方法1、 DNA 提取按照 DNA 提取试剂盒的说明书，从_____样本中提取高质量的基因组 DNA。
对提取的 DNA 进行浓度和纯度检测，确保其质量符合测序要求。
2、文库构建将提取的 DNA 进行片段化处理，使其大小适合测序。
对片段化的 DNA 进行末端修复和加接头等操作，构建测序文库。
3、测序将构建好的测序文库加载到测序仪上，进行测序反应。
选择合适的测序模式和参数，以获得高质量的测序数据。
4、数据处理与分析对测序得到的原始数据进行质量评估和过滤，去除低质量的数据。
使用专业的生物信息学软件对处理后的数据进行比对、组装和变异检测等分析。
四、实验结果（一）测序数据质量评估1、测序深度：平均测序深度达到_____X，覆盖度良好。
2、碱基质量：碱基质量值的分布符合预期，大部分碱基的质量值在 Q30 以上。
（二）基因组装结果成功组装出_____样本的基因组序列，与已知的参考基因组相比，具有较高的一致性。
（三）变异检测结果1、单核苷酸多态性（SNP）：共检测到_____个 SNP 位点，分布在不同的染色体上。
2、插入缺失（InDel）：检测到_____个 InDel 变异，其长度和位置分布具有一定的特征。
（四）功能注释与分析对检测到的变异进行功能注释，发现其中一些变异可能与_____疾病的发生发展相关。
高通量基因组测序中测序深度覆盖度
1G=1024M测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值.假设一个基因大小为2M,测序深度为10X,那么获得的总数据量为20M.测序深度=总数据量20M/基因组大小2M=10X覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例.由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域,这部分没有获得的区域就称为Gap.例如一个细菌基因组测序,覆盖度是98%,那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的.核苷酸多态性位点SNP,插入缺失位点InDel,Insertion/Deletion、结构变异位点SV,StructureVariation位点.SBC可以协助客户,通过手段,分析不同间的结构差异,同时完成注释.技术路线提取基因组DNA,利用Covaris进行随机打断,电泳回收所需长度的DNA片段0.2~5Kb,加上接头,进行cluster制备Solexa或E-PCRSOLiD,最后利用Paired-EndSolexa或者Mate-PairSOLiD的方法对插入片段进行重测序.图1-1,以SOLiD为例,说明整个实验方案.2、外显子测序也称目标组捕获,是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法.是一种选择基因组的的高效策略,外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势.外显子expressedregion是真核生物基因的一部分,它在剪接Splicing后仍会被保存下来,并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质.外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列.既存在于最初的产物中,也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列.在人类基因中大约有180,000,占人类基因组的1%,约30MB.。
测序常用名词解释整理
高通量测序领域常用名词解释大全什么是高通量测序高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。
什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
什么是de novo测序de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。
单细胞测序基因数和数据量关系
单细胞测序基因数和数据量关系
单细胞测序（Single-Cell Sequencing）是一种用于研究单个细胞基因表达的高通量技术。
基因数和数据量之间的关系在单细胞测序中是一个重要的考虑因素。
以下是一些相关的考虑和观点：
1.基因数与数据量：
o单细胞测序的数据量通常与测序深度（每个细胞的平均读数）和测序覆盖度（涵盖基因组中的多少
部分）有关。
o更高的测序深度和覆盖度通常可以检测到更多的基因，尤其是在低表达水平的基因中。
o由于单细胞测序的数据量较大，通常需要处理大量的基因表达矩阵，这可能对数据存储、处理和分
析带来挑战。
2.细胞数和数据量：
o单细胞测序通常包括对多个细胞的测序，细胞数目的增加将显著增加整体的数据量。
o更多的细胞数可能提供更全面的单细胞分析，但也增加了数据处理和存储的复杂性。
3.样本类型和实验设计：
o样本类型和实验设计的选择也会影响单细胞测序的数据量需求。
例如，研究者可能在相同数量的细
胞中选择深度测序较高的样本，以便更深入地探
索细胞的基因表达。
4.技术平台：
o使用不同的单细胞测序技术平台（如10x Genomics、Drop-seq等）可能会对数据量产生影
响。
一些平台可能更适合高通量测序，而另一些则
更适合特定实验设计或预算。
总体而言，单细胞测序的数据量需求是一个平衡问题，需要根据具体研究目的、预算和实验设计来确定。
在进行单细胞测序实验时，研究者应该仔细考虑数据量的要求，以确保能够满足科学问题的需要。
全基因组测序指南（一）：名词解释
全基因组测序指南（一）：名词解释Barcode条形码，因为在测序过程中往往是多个样本一起测序，所以Barcode的作用就是区分测序产生序列到底是来源于哪一个个体；另外，10X Genomics在测序过程中也用到了Barcode，其作用是区分测序产生的序列是否来源于同一个大片段，更加有利于组装成更高质量的基因组。
BAC细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome），可以构建超长片段的DNA序列，在基因组组装过程中有助于组装更高质量的基因组，也可用于基因组的组装质量评估。
Contig拼接软件基于reads之间的重叠（overlap）区，拼接获得的没有gap的序列称为Contig（重叠群）。
与之对应的一个概念是Scaffold：是指将获得的Contig根据大片段文库的Pair-end关系，将Contig进一步组装成更长的序列。
ContigN50衡量Contig的一个指标。
即将所有的Contig长度相加，获得一个Contig总长度，然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序，将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig为总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为ContigN50。
ContigN90概念与N50的类似，即当相加的长度达到Contig总长度的90%时，最后一个加上的Contig长度即为Contig N90。
N50或者N90是衡量基因组质量的一个重要指标。
ScaffoldN50衡量Scaffold的一个指标。
即将所有的Scaffold长度相加，获得一个Scaffold总长度，然后将所有的Scaffold按照从长到短进行排序，将Scaffold按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Scaffold总长度的一半时，最后一个加上的Scaffold长度即为Scaffold N50。
ScaffoldN90的概念与N50的类似，即当相加的长度达到Scaffold总长度的90%时，最后一个加上的Scaffold长度即为Scaffold N90。
全基因组重测序数据分析详细说明
全基因组重测序数据分析1. 简介(Introduction)通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。
我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。
实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。
在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。
对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。
5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。
高通量测序常用名词解释
什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。
什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
什么是de novo测序de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。
测序常用名词解释整理
高通量测序领域常用名词解释大全什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencin，g HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencin，g NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing。
)什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger法测序利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或C 处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs 和ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencin）g全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
什么是de novo 测序de novo 测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。
测序原始数据参数
测序原始数据参数测序原始数据（Raw Data）通常指的是测序仪器直接产生的未经处理的数据。
这些数据通常以fastq文件格式存储，记录了测序样本的碱基序列信息以及与之相关的质量评分。
在处理这些原始数据时，通常会涉及一些参数设置，以下是一些常见的参数及其说明：1. 测序平台与试剂：不同的测序平台（如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等）和试剂会影响数据的质量和产出。
因此，了解所使用的测序平台和试剂对于数据解读至关重要。
2. 测序深度：测序深度指的是测序覆盖的基因组区域的倍数。
较高的测序深度可以提高数据的准确性和可靠性，但也会增加成本和计算负担。
3. 质量评分系统：测序数据中的每个碱基通常都会有一个与之相关的质量评分，用于表示该碱基的测序可靠性。
不同的测序平台和软件可能使用不同的质量评分系统，如Illumina的ASCII编码或Sanger 的Phred编码。
4. 数据过滤：在原始数据中，可能存在一些低质量的序列或碱基，这些数据在后续分析中可能会产生干扰。
因此，通常需要对原始数据进行过滤，去除低质量的序列或碱基。
过滤的标准可能包括序列长度、平均质量评分等。
5. 数据拆分与合并：对于双端测序（Paired-End Sequencing）产生的数据，需要将两个端的数据进行拆分和合并。
拆分时需要根据测序引物的序列和位置信息来确定每个端的数据范围；合并时则需要将两个端的数据按照基因组的位置信息进行拼接。
6. 数据压缩与存储：由于原始数据通常较大，为了方便存储和传输，可能需要对数据进行压缩。
常用的压缩格式包括gzip（.gz）和bzip2（.bz2）等。
了解这些参数对于正确处理和解读测序原始数据至关重要。
在实际操作中，建议根据具体的测序平台、试剂和实验需求来选择合适的参数设置。
高通量测序基础知识
高通量测序基础知识简介陆桂什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。
什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
什么是de novo测序de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。
数据分析文献阅读测序深度和覆盖度
精品课件
转录组测序
17
在RNA-seq的分析中基因或者转录物的丰度经常用 FPKM来表示。 FPKM=(total exon fragments)/(mapped reads(millions)* exon length(kb))
精品课件
基因组重测序
10
测序的策略取决于测序深度和样本数量之间的权衡。 WGS（全基因组测序）：高深度的WGS方法对
DNA测序来说是黄金准则，因为它几乎可以探测到 所有的变异类型。 WES（全基因组外显子测序）：WES主要探测在蛋 白质编码基因中的SVNs（单核苷酸变异）、indels （插入缺失）和其他的功能元件，因此它忽略了调 节元件比如启动子和增强子。WES的测序花费比 WGS要少，但它具有各种的限制条件。
群体基因组测序中，许多基因组的测序都是短阅读序 列的方法，比如：400个样本，4倍的覆盖度。
精品课件
基因组重测序
13
四种不同测序策略（WES,WGS,RNA-seq,ChIp-seq) 的测序对深度的要求也不相同。
它们的测序深度和测试的花费按以下的顺序递增： ChIp-seq,RNA-seq,WES,WGS。
经常使用混合的方法得到高质量的拼接，比如高深度、 短阅读测序的优势常与低深度但是长阅读测序法相结 合。
精品课件
基因组从头测序
7
例如野生草山羊序列的拼接，因为它具有4.4Gb并且 三分之二的区域有高度重复的转座元件，所以测序非 常困难。
首先据，其中的覆 盖率达到了90倍。
基因组分析的关键因素 —测序的深度和覆盖度
RNA-seq数据分析指南
RNA-seq数据分析指南五月份看了一篇2016年的RNA-Seq文献综述，那篇文献特别长，花了三四天时间才看完。
当时为了做组会文献报告做了一些许总结，以ppt的形式呈现出来。
内容前言•各位同学/老师，大家好，现在由我给大家讲讲我的文献阅读报告！•A survey of best practices for RNA-seq data analysis ,我把它叫做RNA-seq数据分析指南。
这篇文章是由佛罗里达大学等单位的研究人员在1月26日发表在Genome Biology上的，该期刊的影响因子有10.8分。
这是这篇文章的通讯作者，应该挺靠谱的。
•新一代测序技术在爆炸式发展的同时，也衍生出许多其他技术创新。
RNA-Seq就是其中之一，这项技术使我们对细胞发育及其调控机制的理解，达到了前所未有的深度和广度。
RNA-seq可以获得相当惊人的数据量，而这恰恰是一柄双刃剑。
丰富的数据量蕴含着大量的宝贵信息，但这样的数据需要复杂的生物信息学分析，才能从中提取到有意义的结果。
•正因如此，数据分析可以说是RNA-seq的重中之重。
RNA-seq 有非常广泛的应用，但没有哪个分析软件是万能的。
科学家们一般会根据自己的研究对象和研究目标，采用不同的数据分析策略。
现在人们已经发表了大量的RNA-seq和数据分析方案，对于刚入门的新手来说难免有些无所适从。
这篇文章概述了RNA-seq生物信息学分析的现行标准和现有资源，为人们提供了一份RNA-seq数据分析指南，可以作为开展RNA-seq研究的宝贵参考资料。
•这份指南覆盖了RNA-seq数据分析的所有主要步骤，比如质量控制、读段比对、基因和转录本定量、差异性基因表达、功能分析、基因融合检测、eQTL图谱分析等等。
研究人员绘制的RNA-seq分析通用路线图(标准Illumina测序)，将主要分析步骤分为前期分析、核心分析和高级分析三类。
前期预处理包括实验设计、测序设计和质量控制。
一代测序质量标准要求
一代测序质量标准要求
1. 测序错误率：测序错误率是指测序过程中碱基识别错误的频率。
一代测序质量标准要求测序错误率较低，通常要求在0.1%以下。
2. 测序覆盖深度：测序覆盖深度是指基因组中每个位置被测序的次数。
一代测序质量标准要求测序覆盖深度足够高，通常要求在10倍以上，以保证测序结果的准确性。
3. 测序均匀性：测序均匀性是指测序系统在不同位置进行测序的能力是否一致。
一代测序质量标准要求测序均匀性较好，避免存在位置偏差较大的情况。
4. 测序标记质量：测序标记质量是指测序过程中使用的荧光标记物的质量。
一代测序质量标准要求使用高质量的荧光标记物，以保证测序结果的准确性和可靠性。
5. 数据准确性和可靠性：一代测序质量标准要求测序结果的数据准确性和可靠性较高，以保证后续的数据分析和应用的准确性。
总的来说，一代测序质量标准要求测序结果的准确性、可靠性和一致性较高，以确保测序数据的质量和可应用性。
测序报告解读
测序报告解读基因测序技术是一种基于生物技术的手段，通过对基因序列的测定和分析，可以揭示生物体的遗传信息、生命活动中的变化规律以及与疾病发生、发展的关系。
下面将针对一份基因测序报告进行解读。
一、报告概述本报告是一份关于人类基因组的测序报告，旨在分析基因组中可能存在的变异及其与疾病的关系。
测序样本来源于一名男性受试者，测序平台为Illumina HiSeq X Ten。
二、基因组信息1.基因组覆盖度：报告显示测序覆盖度为99.9%，即绝大部分基因组区域已被成功测序。
2.SNV（单核苷酸变异）：报告共检测到324329个SNV，其中已注释变异为275988个，未注释变异为48341个。
这些变异中，有30206个被预测为可能影响蛋白质编码的变异。
3.Indel（插入缺失）：报告共检测到60461个Indel，其中已注释变异为56819个，未注释变异为3642个。
这些变异中，有785个被预测为可能影响蛋白质编码的变异。
三、变异注释1.已知变异：报告中大部分已知变异与公共数据库（如dbSNP、1000 Genomes等）中的已知变异一致，这些已知变异经过了大量人群的验证，通常被认为是无害的或低风险的。
2.未知变异：报告中也检测到一些未被注释的变异，这些变异可能是新的或者在特定人群中特有的。
对于未知变异，需要进一步的研究来确认其生物学意义和与疾病的关系。
四、基因组注释1.基因区：报告对检测到的变异进行了基因区注释，即确定变异所在的基因及其位置。
这有助于理解变异对基因表达和蛋白质功能的影响。
2.疾病关联：报告还针对检测到的变异进行了疾病关联注释，即确定变异是否与特定疾病有关联。
根据注释结果，部分变异已被证实与多种疾病有关，如癌症、心血管疾病等。
但也有部分变异尚未被明确与疾病关联，需要进一步研究。
五、结论和建议本基因测序报告提供了受试者基因组中可能存在的变异信息，以及这些变异与疾病关联的可能性。
尽管报告中列出了一些已知和未知的变异，但这些变异是否真的与疾病有关以及它们如何影响健康还需要进一步的研究和验证。
高通量测序(NGS)数据分析中的质控
高通量测序错误总结一、生信分析部分1）Q20/Q30碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标，质量值越高代表碱基被测错的概率越小。
Q30 代表碱基的正确判别率是99.9% ，错误率为0.1% 。
同时我们也可以理解为1000 个碱基里有 1 个碱基是错误的。
Q20 代表该位点碱基的正确判别率是99% ，错误率为1% 。
对于整个数据来说，我们可以认为100 个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿y- 轴将坐标图分为 3 个区：最上面的绿色是碱基质量很好的区，Q 值在30 以上。
中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区，Q 值在20-30 之间。
最下面红色的是碱基质量很差的区。
在一些生信分析中，比如以检查差异表达为目的的RNA-seq 分析，一般要求碱基质量在Q 在Q20 以上就可以了。
但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在Q30 以上。
一般来说，测序质量分数的分布有两个特点：1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。
2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。
在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要做剪切（trimming），根据生信分析的目的不同，要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。
2）序列的平均质量这个是碱基序列平均质量报告图。
横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列数量。
通过序列的平均质量报告，我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。
一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30，可以判断序列质量较好。
如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显著数量的低质量序列。
但如果曲线如右边的图所示，在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。
3）GC含量分布这个是GC含量分布报告图。
GC含量分布检查是检测每一条序列的GC含量。
基因检测数据分析要点
测序数据质量分布图
GC含量分布检查
Alignment比对
常用软件：1. BWA 2. Samtools 3. Picard
SNV和Indel
GATK best Practices and Broad pipelines
基因注释 正常人频率
注释
注释
突变/基因与疾病关 系的注释
突变频率注释
筛选
突变类型
PP （Supporting）
1. 遗传共分离 2. 该基因很少有良性变异 3. 软件预测均致病（SIFT／PolyPhen） 4. 单基因病因 5. 其他实验室数据表明致病
致病性突变位点分级
变异等级
证据 Evidence of Benign
BA(Stand alone) BS(Strong)
MAF>5%（任何一个正常人数据库）
二代测序报告模板
功能筛选
千人数据 库等
OMIM
家系验证
HGMD
ACMG指南
1. ACMG评判： 2. 该位点父母验证结果是新生突变；(PS) 3. 相关基因已报道，与临床症状相符；(PS) 4. 正常人群中频率低，不出现；(PM)
基因检测数据分析要点及案例
突变位点筛选方案
• 临床过滤—以临床表型为依据进行突变过滤 Clinical filter—phenotype-driving variant analysis
案例3-癫痫检测特殊案例
判断致病性：
11. .母正亲常无人突群变中，频率孩低子，有不突出现变；：(P新M生) 突变； 223. ..患终相者止关是突基男变因孩，被，蛋报白道X染被 与截 癫色断 痫体， 性上功脑是能病杂丧相失关合；，突与(P变V临S？)床症状相符；(PS) 45嵌.. 合该该位位？点点XX父被Y母报？验道X证过染结 与色果 疾体是 病上新 相的发 关突 ，片变 为段； 致重病(P复S位) ？点；（PS）
测序结果判断标准
测序结果判断标准
测序结果判断标准包括以下几个方面：
1. 蛋白质序列覆盖度：表示测序结果中已确定的氨基酸序列在目标蛋白质中的比例。
较高的覆盖度意味着测序结果更准确且可信度更高。
2. 序列变异和修饰：分析测序结果中的氨基酸变异和修饰信息，如突变、糖基化、磷酸化等，这些对蛋白质的功能和特性具有重要影响。
3. 蛋白质家族和结构域：根据测序结果推断蛋白质所属的家族和结构域，以便进一步研究其结构、功能和相互作用。
此外，峰图也是判断测序结果好坏的重要依据。
如果峰图杂乱无章，测序干扰较大，没有明显主峰，可能是由于测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。
如果菌样或质粒样品无信号，可能是由于菌液浓度太低甚至失活，或者载体为低拷贝，造成提取的质粒浓度低，测序无法产生足够信号。
以上内容仅供参考，如需更准确的信息，可以请教生物信息学专家或查阅相关文献资料。
数据分析文献阅读_测序深度和覆盖度剖析
基因组重测序
• 测序的策略取决于测序深度和样本数量之间的权 衡。 • WGS（全基因组测序）：高深度的WGS方法对 DNA测序来说是黄金准则，因为它几乎可以探测 到所有的变异类型。 • WES（全基因组外显子测序）：WES主要探测在 蛋白质编码基因中的SVNs（单核苷酸变异）、 indels（插入缺失）和其他的功能元件，因此它忽 略了调节元件比如启动子和增强子。WES的测序 花费比WGS要少，但它具有各种的限制条件。
基因组重测序
• WGS：80x的覆盖度要求覆盖89.6–96.8% 的目标碱基，这取决于测序的平台但是至 少要10x的覆盖度。 • 外显子的研究中要求至少80%的目标区域 被覆盖，并且使用10x的覆盖度。 • 群体基因组测序中，许多基因组的测序都 是短阅读序列的方法，比如：400个样本， 4倍的覆盖度。
基因组分析的关键因素 —测序的深度和覆盖度
李言 2014-08-19
目录
• 基因组从头测序
• 基因组重测序 • 转录组测序 • 基因定位分析
基本概念
• 测序深度：测序得到的碱基数量与待测基因组的 比值，假设一个基因大小为2M，测序深度为10X， 那么获得的总数据量为20M。 • 测序覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比 例，例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%， 那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 • Gap:由于基因组中复杂结构（高GC，重复序列） 的存在，使得测序最终拼接组装获得的序列往往 无法覆盖所有的区域，这部分区域就是Gap。
转录组测序
• RNA-seq:可以对生物样本的表达转录物进 行检测和量化分析，但没有明确的指南和 阅读数量的要求。 • 它的应用主要包括：异常转录物的发现， 差异性表达和可变剪接的分析。 • 转录组测序中的覆盖度：读码序列的数量 取决于RNA的最小丰度；有用的读码序列 可以通过减少核糖体RNA，丰富RNA的数 目来进行优化。
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基因组重测序
• 四种不同测序策略（WES,WGS,RNAseq,ChIp-seq)的测序对深度的要求也不相 同。 • 它们的测序深度和测试的花费按以下的顺 序递增：ChIp-seq,RNA-seq,WES,WGS。 • ChIp-seq，WES,WGS具有典型的应用和 标准的测序深度，但是RNA-seq的深度与 它们不一致，并且差距非常之大。
基因定位分析
• 基因定位分析主要有两种方法：ChIp-seq （染色质免疫共沉淀测序）和3C（染色体 构象捕获）。
• 定位分析的位点主要包括：DNA-蛋白质相 互作用位点、RNA-蛋白质相互作用位点、 RNA-DNA相互作用位点和DNA-DNA相互 作用位点
基因定位分析
• ChIp-seq鉴定DNA-蛋白质相互作用位点：
基因组分析的关键因素 —测序的深度和覆盖度
李言 2014-08-19
目录
• 基因组从头测序
• 深度：测序得到的碱基数量与待测基因组的 比值，假设一个基因大小为2M，测序深度为10X， 那么获得的总数据量为20M。 • 测序覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比 例，例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%， 那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 • Gap:由于基因组中复杂结构（高GC，重复序列） 的存在，使得测序最终拼接组装获得的序列往往 无法覆盖所有的区域，这部分区域就是Gap。
基因组从头测序
• 指不依赖于任何已知基因组序列信息对某 个物种的基因组进行测序。 • 决定测序深度的主要因素是错误率、拼接 算法、读码序列的长度和基因组的重复的 复杂性。 • 经常使用混合的方法得到高质量的拼接， 比如高深度、短阅读测序的优势常与低深 度但是长阅读测序法相结合。
基因组从头测序
• 例如野生草山羊序列的拼接，因为它具有 4.4Gb并且三分之二的区域有高度重复的转 座元件，所以测序非常困难。 • 首先成据，其中的覆盖率达到了90倍。 • 然后这些片段可以使用双尾阅读信息与长 的支架进行串联。
1、最初的ChIp-seq技术仅仅可以检测样本 中已经测序的2~5百万的阅读片段。
2、影响ChIp-seq实验中阅读数目的重要因 素是蛋白质是否是点源因子、广源因子或 混源因子。
基因定位分析
• 单源因子出现在基因组的特异位点中，包 括：序列特异性转录因子、非常狭小的染 色质标记；这些单源因子与增强子和转录 起始位点结合。 • 广源因子一般覆盖基因组的扩展区域，比 如许多染色质标记：histone H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3) marks • 混源因子比如RNA聚合酶II,产生以上两种谱 峰。广源因子和混源因子比单源因子要求 更多的读码序列。
基本概念
• Lander–Waterman公式：揭示人类基因组 和外显子组测序的一般性规律。 • 从公式中知：通过试算基因组的测序深度 的方差来评估覆盖度的均匀性非常重要。 • 从Box1中知：覆盖度越高最后测序的碱基 数也越多，而且读码序列的个数与长度之 间具有一定的关系,并且在一定的比例时测 序效果最好。
转录组测序
• RNA-seq:可以对生物样本的表达转录物进 行检测和量化分析，但没有明确的指南和 阅读数量的要求。 • 它的应用主要包括：异常转录物的发现， 差异性表达和可变剪接的分析。 • 转录组测序中的覆盖度：读码序列的数量 取决于RNA的最小丰度；有用的读码序列 可以通过减少核糖体RNA，丰富RNA的数 目来进行优化。
基因组从头测序
• 低覆盖度在测序后分析和生物学解释方面 有两个主要的影响： 1、它不能确定是否有编码蛋白质基因的缺失、 开放阅读框的中断、一个真正的进化基因 的丢失。 2、更严重的是低覆盖度会产生序列的错误， 并且会随着下游的分析和误导性的结论而 进行扩散。
基因组重测序
• 对基因组序列已知的个体进行基因组测序， 并在个体或群体水平上进行差异性分析。 与已知序列比对，寻找单核苷酸多态性位 点（SNP）、插入缺失位点（InDel）、结 构变异位点（SV，Structure Variation）位 点及拷贝数变化 (CNV) 。 • 测序的深度取决于研究的变异类型、疾病 的类型和区域的长度。
基本概念
• 覆盖度的冗余也叫深度或覆盖深度。LN/G表示： L代表阅读的长度，N代表阅读序列的数量，G代 表单倍体基因组长度。 • 一般而言，越高覆盖度的测序方法往往要求越高 的花费。 • 真实的测序方法中读码序列很短（小于250个核 苷酸），并且有错误；可以通过增加读码序列的 数量来克服它，比如：具有1%错误变异率的译码， 在结合8个相同的包含变异位点的序列后可以使错 误率变为十万分之一。
总结
• 使用测序方法时有许多的因素可以影响到 测序的深度和覆盖度。 • 我们在设计实验时候要考虑以下的问题： 基因组结构的差异、转录组的复杂性、阅 读的可作图性、测序深度和控制性、复制 性之间的权衡。 • 未来的实验方法会因测序成本的降低而改 进，主要表现在样本数量的增加方面。
总结
• 测序成本的降低也可以增加测序的深度， 从而提高其准确性。 • 未来测序技术的改进，比如：阅读长度的 增加和错误率的减少；可以减少基因组测 序的深度，但是对RNA-seq和ChIp-seq却 没有多在作用。
转录组测序
• 转录物如果分子以每100万个中0.6-2.5个的频率出现， 使用12.4millions特异映射的36bp阅读片段是无法 被检测的。 • 基因组的转录能力影响阅读的深度，哺乳动物中 有成千上万个基因，大多基因都有复杂的结构， 转录时通常跳过基因间序列；而单细胞真核生物、 细菌等含有较少的复杂的基因结构，所以转录产 物也比较少。
转录组测序
• 在RNA-seq的分析中基因或者转录物的丰 度经常用FPKM来表示。 FPKM=(total exon fragments)/(mapped reads(millions)* exon length(kb))
• 当前计算FPKM时通常用75%的reads数量 代替映射到的reads数量。
基因组重测序
• WGS：80x的覆盖度要求覆盖89.6–96.8% 的目标碱基，这取决于测序的平台但是至 少要10x的覆盖度。 • 外显子的研究中要求至少80%的目标区域 被覆盖，并且使用10x的覆盖度。 • 群体基因组测序中，许多基因组的测序都 是短阅读序列的方法，比如：400个样本， 4倍的覆盖度。
基因组重测序
• SNV和indel检测：使用Illumina短阅读技术表明， 纯合型的SVNs的检测使用15x的覆盖度，杂合型 的为33x。变异检测的能力会因碱基的质量低和覆 盖度不均匀而下降。 • CNV检测：CNVs可以通过对WES和WGS两种测 序的数据使用分析覆盖深度来得到，其中拷贝数 目的变化可通过基因组区域的覆盖深度的变化推 导得到。在WGS中0.1x的覆盖度可以获得合理的 特异位点。 • 基因组重测序数据的分析：典型的重测序数据的 分析途径是把测序的短序列与参考的基因组进行 比对。
基因定位分析
• 从图2中知： 1、单源因子产生几百个碱基对的狭窄的谱峰。 2、广源因子产生大范围的增强的信号。 3、混源因子产生一定范围的增强区域。 • ChIp-seq实验中三种因子的要求： 1、单源因子应该在哺乳动物中对每个因子使用20 个million的reads，或者在组织和小的基因组中使 用2个million的reads,比如果蝇和线虫。 2、广源因子和混源因子对reads的大致数量并不清 楚，一般而言是40个million的reads。
基因组重测序
• 测序的策略取决于测序深度和样本数量之间的权 衡。 • WGS（全基因组测序）：高深度的WGS方法对 DNA测序来说是黄金准则，因为它几乎可以探测 到所有的变异类型。 • WES（全基因组外显子测序）：WES主要探测在 蛋白质编码基因中的SVNs（单核苷酸变异）、 indels（插入缺失）和其他的功能元件，因此它忽 略了调节元件比如启动子和增强子。WES的测序 花费比WGS要少，但它具有各种的限制条件。
转录组测序
• 例如：比如仅仅四百万个阅读序列就可以 检测到酵母的80%的基因（至少4个reads 映射到它的3‘末端），随着额外数据的添 加加被检测基因的数量增加的并不明显。 • 差异性表达分析：由于外部的刺激或是实 验的偏差造成的基因表达的差异是非常有 用的，经常用于推导生物体内的特异路径， 产生意外的假说。
转录组测序
• 可变剪接的分析：RNA-seq实验可以整合 外显子阅读的信息，来检测是否有替代亚 型。人类基因中的大部分都是被可变剪接 的，外显子的跳读是可变剪接的主要类型。 • 早期两种可变剪接的研究中每个样本使用 3.5到4.4个百万的27-bp的reads,和12到29 个百万的32-bp的reads。 • 最近的一项研究使用~30million的80-bp的 单尾reads去鉴定老鼠组织中的不同类型的 外显子。