PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA

001963 J.S hanxi Agric .Un i v .

学报

收稿日期:

2004-04-20 修回日期:2004-05-17

作者简介:常 泓(1968-),女(汉),山西榆次人,副教授,博士,主要从事分子生物学及生物技术的研究。

基金项目:国家自然科学基金资助课题(30271003);山西省科技攻关项目(011030);山西省青年基金项目(20021038)

文章编号:1671-8151(2005)01-0064-04

PCR 法扩增钙激活酶激活蛋白c DNA

常 泓1

,南庆贤2

,岳文斌

3

(1.山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801; 2.中国农业大学食品学院,北京100094;3.山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801)

摘 要:钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白,可以促进钙激活酶活性的发挥,从而促进肉的嫩化。采用PCR 技术,以山羊肝脏cDNA 为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(ca l pa i n activator)基因,并进行了序列测定。该片段长1017bp ,5 端非翻译区长39bp ,3 端非翻译区长567bp 。编码区长411bp ,编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子量为14298D a 。与Edon M e llon i 等(1998)报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现,二者仅有五个位点不同。关键词:钙激活酶激活蛋白;

cDNA 文库;聚合酶链式反应

中图分类号:S81 文献标识码:A

Am plificati o n of C al p ain A ctivat or c DNA usi n g PCR CHANG Hong et a.l

(C olle ge of L i f e S cience ,Shanx i Agr icultural Universit y,T ai gu Shanx i 030801,China )Abstract :T he c DNA o f ca l pa i n activator ,

a prote i n that can ac tivate calpa i n ,w as a m plified by po l ym erase chain reacti on

(PCR )w it h te m plate of cDNA of goat li ve r .T he a mp lified frag m ent w as c l oned and sequenced .The c DNA,cons i sti ng o f 1017bp ,had a 5 un translated reg ion of 39bp and 3 untranslated reg i on o f 567bp .The cod i ng reg i on w as 411bp i n s i ze and encoded a pepti de o f 137a m i no ac i d resi dues w ith a theoretical m olecu lar m ass o f 14298D a .Compar i ng w ith t he resu lt o f Edon M ell on i e t .al (1998),there w ere fi ve d ifferen t site o f a m i no acid .K ey word s :Ca l pa i n acti va t o r ;

c DNA library ;PCR

最新的研究表明,钙激活酶激活蛋白(cal pa i n activator )[1]

是钙激活酶(calpa i n EC 3 4 22 17)活性的主要调节者,对活体组织中钙激活酶活性的发挥起着主要的激活作用。钙激活酶激活蛋白是钙激活酶系统中除钙激活酶抑制蛋

白(cal p astati n )[2]

外的另一个调节者,钙激活酶激活蛋白是钙激活酶系统的一个新成员。

钙激活酶系统是高度可调的、依赖于C a 2+

的蛋白质水解酶系统,参与细胞内一系列变化。[2~5]

在活体肌肉组织中,钙激活酶是导致肌纤维蛋白降解的主要因素[2,4]

。试验研究还表明,钙激活酶同样是宰后肌肉成熟过程中肌原纤维降解的主要因素,直接关系到肉的嫩化程度,而嫩度是影

响肉品质的关键因素[6]

。促进肉嫩化,提高肉的

嫩度是畜牧业和食品工业面临的一个很重要的问

题。但是,活体组织中钙激活酶是如何被激活的一直是个迷,如何激活钙激活酶而促进肉嫩化更

无法实现。近年来,许多科学家分析[7]

,在钙激活酶系统中存在一个钙激活酶活性的直接调节者,

它可以增强钙激活酶在生理条件下对Ca 2+

的亲和

性,促进C a 2+与钙激活酶在C a 2+

结合位点结合,从而促进钙激活酶活性的发挥。

首次发现钙激活酶激活蛋白的是美国Texas 健康科学中心大学生理和药理系D e M arti n o 等人[1]

。1998年以来[8~10]

,意大利热那瓦大学生化研究所的Pontre m o li 和M ellon i 等人对钙激活酶激活蛋白的研究较多。目前已知其氨基酸序列和c DNA 序列。钙激活酶激活蛋白是一个分子量为

30KD 的二聚体,对热稳定,可耐93!的高温,作用最适p H 为7 0~7 1。其氨基酸顺序与山羊肝脏蛋白UK114几乎一样;与小鼠HR12蛋白很相似;与流感嗜血杆菌(H ae m oph il u s i n fl u enzae)和枯草芽孢杆菌(B ac illus subtillis)获得的Y J GF 和YABG 两种热稳定蛋白有很大的相似点[11]

。

目前有关钙激活酶激活蛋白的研究正在兴起,但国内尚未见此类报道。

本研究根据GenBank 中UK 114的c DNA 序列克隆得到钙激活酶激活蛋白c DNA 序列,并进行了序列分析。

1 材料与方法

1 1 材 料

山羊肝脏购自河北省大厂县韦子庄村。大肠杆菌BL 21(DE 3)宿主菌购自鼎国生物技术中心。1 2 试 剂

山羊肝脏c DNA 文库构建所用试剂盒:mR NA 的提取:Qu ick Prep TM

M icro Purification K it 安发玛西亚生物技术公司(Am ersha m Phar m ac i a

B iotech .)产品;cDNA 的合成:T i m e Saver TM

c D NA synthesis k it 安发玛西亚生物技术公司(Am er sha m Phar m ac ia B iotech .)产品;噬菌体的包装及转染:Pr o m ega 公司Packagene La m da DNA packing syste m 。

DNA 的快速纯化/回收试剂盒:购自北京鼎国生物技术公司。1 3 方 法

1 3 1 山羊肝脏c DNA 文库的构建

根据试剂盒说明,采用cDNA 的快速构建法。1 3 2 山羊肝脏c DNA 文库 噬菌体DNA 的提取

平板裂解法。

1 3 3 PCR 扩增calpai n acti v ator c DNA 序列

引物1:5 gacca tggca tgtcg tcttt ggtca ga 3 ,引物2:5 gagga tccaa tctgc atgct atttc a tttc ca 3 。PCR 反应体系:每个反应总体积50 L ,其中dd H 2O 37 L ,d NTP (10mM )1 L ,10∀buffer 5 L ,模板( 噬菌体)2 L ,引物1和引物2各2 L ,Taq pl u s 酶(2U / L)1 L ,各组分混匀后加50 L 石蜡油,在美国M J Research 公司PTC 200型PCR 仪上进行反应:94!预变性2m i n ;94!变性50Sec ,55!复性50Sec ,72! 延

伸50Sec ,经35个循环,再72!延伸加时10m in 。

琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果:配制2%琼脂糖凝胶,取10 L 扩增产物电泳。保持电流40mA 。电泳结束后,用EB 染色15m in ,紫外灯下观察结果。

1 3 4 DNA 片段的回收

根据c DNA 纯化/回收试剂盒进行1 3 5 PCR 产物与pGE M T 载体的连接

T 载体DNA 的回收:

(10 L 体系:T 载体

5 L ,PCR 产物3 L,T 4DNA 连接酶1 L)4!过夜。

转化:

-80!冻存感受态菌BL 21(DE3),

溶化后取100 L,加入上述连接产物,冰浴放置30m in ,42!,90s ,加入500 LLB 培养基,

37!振摇培养2小时,铺于IPTG LB 平板,两板均有白色菌落生长。1 3 6

序列测定

应用Sanger 双脱氧核苷酸链终止,在AB I 377型全自动测序仪进行序列分析。

2 结果和讨论

2 1 山羊肝脏c DNA 的建立

该文库滴度为5 2∀106

pf u /mL ,经推算得到

的克隆数为1 3∀106

,理论上可以从该文库中筛选到所要的目的基因。

2 2 钙激活酶激活蛋白c DNA 的PCR 扩增

采用平板裂解法对所构建的山羊肝脏cDNA 文库中进行筛选,所得产物经纯化和回收后,设计引物1:5 gacca tggca tg tcg tcttt gg tca ga 3 和引物2:5 gagga tccaa tctgc atgct atttc atttc ca 3 进行PCR 基因扩增,所得片段为长约1kb 的产物,根据文献报道分析该产物即为所需的钙激活酶激活蛋白的基因序列(图1)。

1.DNA 标准

2.PCR 产物

3.对照1.M arker 2.PCR product 3.Negati ve control

图1 钙激活酶激活蛋白编码区基因PCR 扩增图Fig .1 The PCR fragm ent o f ca l pain acti vato r gene

cod i ng reg ion

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