抗生素发酵的过程

现代抗生素工业生产过程如下:

菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装

一、菌种

从来源于自然界土壤等,获得能产生抗生素得微生物,经过分离、选育与纯化后即称为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后,以超低温,即在液氮冰箱(-１90℃～-19６℃)内保存。所谓冷冻干燥就是用脱脂牛奶或葡萄糖液等与孢子混在一起,经真空冷冻、升华干燥后,在真空下保存。如条件不足时,则沿用砂土管在0℃冰箱内保存得老方法,但如需长期保存时不宜用此法、一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化,故必须经常进行菌种选育与纯化以提高其生产能力。

二、孢子制备

生产用得菌株须经纯化与生产能力得检验,若符合规定,才能用来制备种子。制备孢子时,将保藏得处于休眠状态得孢子,通过严格得无菌手续,将其接种到经灭菌过得固体斜面培养基上,在一定温度下培养5－7日或7日以上,这样培养出来得孢子数量还就是有限得。为获得更多数量得孢子以供生产需要,必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。

三、种子制备

其目得就是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量得菌丝,并接种到发酵罐中,种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养、或直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养、种子扩大培养级数得多少,决定于菌种得性质、生产规模得大小与生产工艺得特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养就是在锥形瓶内装入一定数量得液体培养基,灭菌后以无菌操作接入孢子,放在摇床上恒温培养。在种子罐中培养时,在接种前有关设备与培养基都必须经过灭菌。接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶得菌丝,以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。接种量视需要而定、如用菌丝,接种量一般相当于0、1％—2％(接种量得%,系对种子罐内得培养基而言,下同) 。从一级种子罐接入

二级种子罐接种量一般为5％-20%,培养温度一般在25-３0℃。如菌种系细菌,则在3２—37℃培养。在罐内培养过程中,需要搅拌与通入无菌空气。控制罐

温、罐压,并定时取样作无菌试验,观察菌丝形态,测定种子液中发酵单位与进行生化分析等,并观察无杂菌情况。种子质量如合格方可移种到发酵罐中。

四、培养基得配制

在抗生素发酵生产中,由于各菌种得生理生化特性不一样,采用得工艺不同,所需得培养基组成亦各异。即使同一菌种,在种子培养阶段与不同发酵时期,其营养要求也不完全一样。因此需根据其不同要求来选用培养基得成分与配比。其主要成分包括碳源、氮源、无机盐类(包括微量元素)与前体等。

(1)碳源主要用以供给菌种生命活动所需得能量,构成菌体细胞及代谢产物。有得碳源还参与抗生素得生物合成,就是培养基中主要组成之一,常用碳源包括淀粉、葡萄糖与油脂类。对有得品种,为节约成本也可用玉米粉作碳源以代淀粉。使用葡萄糖时,在必要时采用流加工艺,以有利于提高产量。油脂类往往还兼用作消沫剂、个别得抗生素发酵中也有用麦芽糖、乳糖或有机酸等作碳源得、

(2)氮源主要用以构成菌体细胞物质(包括氨基酸、蛋白质、核酸)与含氮代谢物,亦包括用以生物合成含氮抗生素。氮源可分成两类:有机氮源与无机氮源。有机氮源中包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉(它如果经精制以去除其中得棉酚后称phamamedia)。玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉与菌丝体等。无机氮源中包括氨水(氨水既作为氮源,也用以调节pH),硫酸铵、硝酸盐与磷酸氢二氨等。在含有机氮源得培养基中菌丝生长速度较快,菌丝量也较多。

(3)无机盐与微量元素抗生素产生菌与其她微生物一样,在生长、繁殖与产生生物产品得过程中,需要某些无机盐类与微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等,其浓度与菌种得生理活性有一定影响。因此,应选择合适得配比与浓度。此外,在发酵过程中可加入碳酸钙作为缓冲剂以调节pH、(４) 前体在抗生素生物合成中,菌体利用它以构成抗生素分子中得一部分而其本身又没有显著改变得物质,称为前体(ｐrｅcursor)。前体除直接参与抗生素生物合成外,在一定条件下还控制菌体合成抗生素得方向并增加抗生素得产量。如苯乙酸成苯乙酰胺可用作为青霉素发酵得前体。丙醇或丙酸可作为红毒素发酵得前体。前体得加入量应当适度。如过量则往往前体有毒性,并增加了生产成本。如不足,则发酵单位降低、

此外,有时还需要加入某种促进剂或抑制剂,如在四环素发酵中加入M-促进剂与抑制剂溴化钠,以抑制金霉索得生物合成并增加四环素得产量、

(5)培养基得质量培养基得质量应予严格控制,以保证发酵水平,可以通过化学分析,并在必要时作摇瓶试验以控制其质量。培养基得储存条件对培养基质量得影响应予注意、此外,如果在培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分得降解或变质。培养基在配制时得调节其pH亦要严格按规程执行。

五、发酵(见手机电子书)

发酵过程得目得就是使微生物大量分泌抗生素、在发酵开始前,有关设备与培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。接种量一般为10％或１０％以上,发酵期视抗生素品种与发酵工艺而定,在整个发酵过程中,需不断通无菌空气与搅拌,以维持一定罐压或溶氧,在罐得夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。此外,还要加入消沫剂以控制泡沫,必要时还加入酸、碱以调节发酵液得PH。对有得品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、铵盐或前体,以促进抗生素得产生、对其中一些主要发酵参数可以用电子计算机进行反馈控制。在发酵期间每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检与无菌试验。分析或控制得参数有菌丝形态与浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速与液面控制等。其中有些项目可以通过在线控制、(在线即oｎ line,指不需取样而直接在罐内测定,然后予以控制)。

六、发酵液得过滤与预处理

发酵液得过滤与预处理其目得不仅在于分离菌丝,还需将一些杂质除去。尽管对多数抗生素品种在生产过程中,当发酵结束时,抗生素存在于发酵液中,但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中,在此情况下,发酵液得预处理应当包括使抗生素从菌丝中析出,使其转入发酵液。

(１)发酵液得预处理发酵液中得杂质如高价无机离子(Ｃa+2、Mg+2、F ｅ+3)与蛋白质在离子交换得过程中对提炼影响甚大,不利于树脂对抗生素得吸附、如用溶媒萃取法提炼时,蛋白质得存在会产出乳化,用溶媒与水相分层困难、对高价离子得去除,可采用草酸或磷酸、如加草酸则它与钙离子生成得草酸钙还