植物细胞悬浮培养技术
2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
植物细胞悬浮培养技术
植物组织培养技术的过程：
离体的 脱分化 植物组 织、器 官、细 胞 愈伤 组织 再分化 丛芽、根 试 管 苗 小 植 株
鉴别培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发 生特定的化学反应，产生明显的特征变化
胚状体
细胞的全能性
生物体的细胞具有使后代细胞发育成完整 1、定义：
个体的潜能的特性。
2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特
有的全套遗传物质，都有发育成为完整个 体所必需的全部基因，从理论上讲，生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： 受精卵 ＞ 生殖细胞 ＞ 体细胞
植物细胞＞动物细胞
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生 物的基础理论和应用方面的研究
含有 途 不 同 划 分
基础培养基 加富培养基 选择培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基 如血液、血清、酵母浸膏、动植物 组织液等 用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来 用于鉴别不同类型微生物的培养基
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
第八讲植物细胞悬浮培养技术
第八讲：植物细胞悬浮培养技术摘要悬浮培养技术是一种在液态培养基中培育植物细胞的方法。
这种技术可以用于研究植物细胞的生理、生化、遗传和分子生物学。
本文将介绍悬浮培养技术的原理、方法和应用，并讨论其优缺点。
原理悬浮培养技术是将植物细胞悬浮在液态培养基中，并提供足够的营养和适宜的环境条件，促进细胞生长和分裂。
悬浮培养技术可以通过两种方法进行：自然悬浮和机械悬浮。
自然悬浮是指通过培养基中的液体流动和植物细胞的重力作用来保持细胞悬浮状态。
机械悬浮是指通过磁力搅拌或气泡强制产生的涡流来保持悬浮状态。
方法悬浮培养技术的方法主要包括以下步骤：1.选取适当的植物细胞：悬浮培养技术可以应用于多种植物细胞，例如培养基的类型和成分、植物物种、生长条件等，都会影响细胞的生长和分裂。
2.培养基制备：准备含有足够营养物质和适合生长的植物细胞的培养基。
3.细胞分离：使用细胞壁水解酶、酸碱处理或机械方法去除细胞壁，分离单个细胞。
4.细胞培养：将分离的细胞置于液态培养基中，将培养瓶放置拟南芥上，以恒定光照、温度、湿度和通风条件下日夜持续观察培养。
5.细胞传代：留置旺孔1cm左右的细胞，废弃周边细胞，再次培养。
应用悬浮培养技术可以应用于以下方面：1.生物医学研究：通过悬浮培养技术培养人类细胞，可用于药物筛选、治疗性细胞移植和组织工程学等研究。
2.分子生物学研究：由于悬浮培养技术能够大量培养植物细胞，因此可以用于高通量分析、基因克隆和表达、蛋白质组学和代谢组学研究等。
3.植物细胞与组织培养：悬浮培养技术可以用于植物组织和细胞的体外培养，利用悬浮培养技术可以大量制备植物生长激素和次生代谢产物。
优缺点悬浮培养技术有以下优点：1.可以大规模培养细胞。
2.可以简化分离和培养过程，使得实验成本低廉。
3.可以控制培养环境，减少外界干扰。
悬浮培养技术也存在以下缺点：1.悬浮培养技术对培养条件和营养要求非常苛刻，因此需要经验丰富的实验人员进行操作。
2.悬浮培养技术可能会产生细胞堆积的问题，从而影响细胞生长和分裂。
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
悬浮细胞培养
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
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继代
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② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
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③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
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①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
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FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
第八章——植物细胞培养
4、PH和二氧化碳浓度
在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。
二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
第八章-植物细胞培养
植物细胞培养简介
• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。
固体培养(solid culture)
• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。
优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。
烟草细胞接种密度和植板率
影响植板率的因素
(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法
看护培养（nurse culture）
植物细胞大规模培养生产次生代谢物质
如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？
植物细胞悬浮培养的方法
植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。
本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。
一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。
悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。
二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。
培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。
常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。
3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。
一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。
因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。
三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。
2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。
3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。
四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。
(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。
(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。
植物细胞培养(Plant cell culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
低温处理 提高培养体系中细胞同步化的程度
第二节 单细胞培养
细胞平板培养(cell 细胞平板培养(cell plating culture) 植板率: 植板率:能长出细胞团的单细胞在接种单 细胞中所占的比例. 细胞中所占的比例.
看护培养(nurse 看护培养(nurse culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
分选法 通过细胞体积大小分级, 通过细胞体积大小分级,直接将处 于相同周期的细胞进行分选, 于相同周期的细胞进行分选,然后将同 一状态的细胞继代培养于同一培养体系 中. 梯度离心法 流式细胞仪
四、悬浮培养细胞的同步化
饥饿法 饥饿导致细胞分裂受阻, 饥饿导致细胞分裂受阻,使细胞不能合成 DNA,即不能进入S DNA,即不能进入S期;或细胞分裂不能进 行,即不能进入M期. 即不能进入M 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞, 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞,使 细胞滞留在DNA合成前期, 细胞滞留在DNA合成前期,当解除抑制 后,即可获得处于同一细胞周期---G1期的 即可获得处于同一细胞周期---G 同步化细胞. 同步化细胞.
三、悬浮细胞的生长动态
生长呈S 生长呈S形生长曲线 起始密度(x 起始密度(x0):0.5x105-2.5x105 生长速率(p) 生长速率(p) p=(lnxp=(lnx-lnx0)/t 单位体积细胞重量 鲜重:按一定体积取样, 鲜重:按一定体积取样,经真空过滤后称重 干重:真空过滤后, 80℃条件下烘干细 干重:真空过滤后,在80℃条件下烘干细 胞至恒重
植物细胞规模化培养体系的建立
半连续培养(semi半连续培养(semi-continuous culture) 两步培养法 生长培养基 合成培养基
药用植物细胞悬浮培养的研究进展
药用植物细胞悬浮培养的研究进展[通信作者] *高文远，Tel/Fax：（022）87401895，E-mail：pharmgao@1934年，White首次成功地进行了植物细胞的体外培养。
1939年，White和Gautheret首次用实验方法建立了植物组织和器官的人工无菌培养技术。
1940—1976年，科学家们开展了大量的工作进行培养基的筛选和培养方法的探索，使植物细胞和组织培养技术发展成一门精细的实验科学，在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、分离鉴定等方面已经建立了一套标准的操作程序。
1956年，第一个应用细胞培养技术生产天然产物的专利诞生了。
到目前为止，通过药用植物细胞培养研究过的药用植物超过400种，从培养细胞中分离到的次级代谢产品在600种以上，其中60多种药用植物代谢物含量超过或等于原植物的含量。
药用植物细胞培养研究的大部分内容是通过高产组织或细胞系的筛选与培养条件的优化等，以期降低成本及提高次生代谢产物的产量，或者通过对次生代谢产物生物合成途径的调控来达到相同的目的[1]。
同时，许多科学家向药用植物工业化培养方面进行了不懈的努力。
1 药用植物细胞悬浮培养条件的优化1.1 药用植物悬浮细胞培养中物理因素的优化对于药用植物悬浮细胞培养来说，环境中的许多物理因素对细胞的生长、目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。
如温度、光照、pH、电场、磁场、电磁辐射、机械力以及超声波等在药用植物悬浮细胞培养过程都有着十分重要的作用。
在药用植物组织培养中，通常培养温度控制在20～28 ℃，最适温度为（25±2）℃[2]，但不同植物的最适温度不同，且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度很多时候并不一致，因此选择合理的培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键。
Hoopen等[3]曾对长春花Catharanthus roseus细胞的培养过程，Takeda等[4]对草莓细胞的培养过程分别进行温度的阶段性调控，结果都在很大程度上提高了产物的产率。
植物细胞的悬浮培养技术
毕业论文(设计)中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (3)关键词 (3)Abstract (3)Key words (3)前言 (4)1.细胞悬浮培养的定义 (4)2.单细胞制备的方法 (4)2.1 机械法 (4)2.2酶解法 (4)2.3 愈伤组织诱导法 (4)3.悬浮培养的条件 (5)4.细胞初始培养 (5)5.细胞悬浮培养的类型 (5)5.1分批培养 (5)5.2连续培养 (6)6.悬浮培养细胞的同步化 (6)6.1 物理方法 (6)6.1.1 体积选择法 (6)6.1.2低温处理法 (6)6.2 化学方法 (6)6.2.1 饥饿法 (6)6.2.2抑制法 (6)7.规模化培养 (7)8.存在问题与前景展望 (7)8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)8.3前景展望 (7)参考文献 (8)致谢 (8)植物细胞的悬浮培养技术摘要悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.1 细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
植物细胞悬浮培养
押新高考卷 细胞工程(含解析)-备战2024年高考生物临考题号押题(新高考通用)(1)
备战2024年高考生物临考题号押题（新高考通用）押单项选择题细胞工程考向01 植物细胞工程1.（2024·浙江·高考真题）山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。
采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。
下列操作不可行的是（ ）外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A ．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染一、植物组织培养技术1.细胞工程的概念2.植物组织培养技术(1)过程(如菊花的组织培养)培养基须保持适当的温度、(2)植物激素在植物组织培养中的作用3.植物细胞的全能性生长素/细胞分裂素植物组织的发育方向高有利于根的分化，抑制芽的形成 低有利于芽的分化，抑制根的形成 适中促进愈伤组织的形成简记为：“高”根，“低”芽，“中”愈伤栽培稻甲产量高、品质好，野生稻乙种植一次可连续收获多年，提醒①光照：在愈伤组织诱导阶段，对有些植物来说，避光培养有利于细胞脱分化形成愈伤组织。
当愈伤组织再分化出芽和叶时，一定要有光照，有利于叶片内叶绿素的合成。
②植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖，原因是蔗糖既可提供充足的碳源，又可维持相对适中的渗透压。
二、植物体细胞杂交技术及植物细胞工程的应用1.植物体细胞杂交技术无性生殖(1)概念与原理(2)过程其中之一是将秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质。
(3)意义在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势2.植物细胞工程的应用(1)植物繁殖的新途径①快速繁殖：高效、快速地实现种苗的大量繁殖，保持优良品种的遗传特性。
②作物脱毒：利用植物顶端分生区附近(如茎尖)进行组织培养获得脱毒苗。
(2)作物新品种的培育(3)细胞产物的工厂化生产①次生代谢物次生代谢不是生物生长所必需的，一般在项目单倍体育种突变体的利用原理染色体变异和植物细胞的全能性突变和植物细胞的全能性优点明显缩短育种年限产生突变，大幅度改良某些性状过程杂交→花药离体培养→单倍体植株―――――→人工诱导染色体加倍纯合二倍体植株(以二倍体为例)成胚状体等结构C．提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根D．用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异11．（2021·福建·高考真题）科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术流程示意图如下。
植物悬浮细胞系的建立
青竹 生命学院 植物学2ห้องสมุดไป่ตู้10级
定义：植物细胞或小的细胞聚集体 在液体培养基上，于摇床上进行悬 浮培养。 意义 1 细胞可以不断增殖，形成高密度 的细胞群体，适于大规模的培养; 2 能够提供大量较为均匀的细胞， 为研究细胞的生长、分化创造方法 和条件。
研究中的应用：
1 高羊茅作为冷季型坪草，是极具开发潜力的 草坪品种。但存在叶片粗糙、夏季生长缓慢、 易遭杂草侵害。尝试利用遗传转化手段改良其 品质性状。胚性悬浮细胞系生长迅速、重复性 好、易于控制等，以此为受体获得转基因高羊 茅，可在短期内在细胞水平筛选预期突变体 2 水稻悬浮系具有繁殖速度快、颗粒均一、操 作方便等优点，成为水稻转基因的理想受体之 一，也是水稻原生质体高效分离、体细胞融合 和高效再生的关键。
植物细胞悬浮培养操作过程
悬浮培养特点
除气体和挥发性代谢物外， 其他都是密闭的 细胞生长呈S形曲线 需要不断继代
影响悬浮培养的因素
初始接种量 培养基种类及不同激素的浓度 蔗糖浓度 培养条件（温度、摇床转速） 继代周期
生理参数的测定确定继代时期
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤ 细胞鲜重 细胞干重 细胞分裂指数测定 细胞密度测定 细胞活力测定
细胞活力的测定方法
• • • • 相差显微术法 伊凡蓝法 FDA法 TTC法
继代方法
• 用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新 鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。
操作注意事项： 对悬浮细胞继代时，进液口的孔径要小， 只能通过单细胞或小细胞团。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团 沉降，再吸取上层悬浮液。 依次，多次，可建立良好的细胞悬浮液
3 野生甘草资源濒危与甘草需求量日益增加的 供求矛盾，悬浮细胞培养具有繁殖速度快、能 进行大规模培养和可提供较大量均一一致的植 物培养物、并进行植物次生代谢物的生产的优 点。 总之，建成的悬浮系细胞增殖速度快、重复性 好、在基因遗传转化、原生质体的分离、培养 和杂交、突变体筛选以及人工种子等方面有着 广泛的应用，成为现代植物新品种培育的有效 工具之一。
植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产
有效成分含量高。 次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率
可控
遗传因素决定
植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能 力弱、易聚团等特点。
植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有 利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累 和分离。
适合植物细胞培养的反应器应具有适宜 的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。
4.1 细胞悬浮培养的方法(P117)
分批培养法 连续培养法 半连续培养法 细胞固定化培养
分批培养：把细胞分散在一定溶积的培养基中 进行培养。
注：中途不添加也不更换培养基
设备简单，操作方便，重复性好。 适合与突变体筛选和遗传转化的研究。
•悬浮培养细胞增殖曲线
细胞数量
5
23
4
1
1——滞后期、 2——对数生长期
3 高产细胞系的筛选(P113)
3.1高产细胞系 筛选的整体思路
外植体
愈伤组织的诱导筛选
悬浮培养细胞
高产细胞系筛选
高产细胞系的建立
高产细胞株系的特点
• 培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定 的产物
• 细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内 能得到较高产量的终产物
• 代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最 好能将其释放到培养基中
1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小 的细胞团在液体培养基中进行大规模培养
的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实 际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
细胞分裂快，均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬 浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈 鲜艳的乳白或淡黄色。
细胞悬浮培养
3.细胞密实体积
为了测定细胞密实体积（packed cell volume, PCV )，将一已知体积的均匀分散的悬浮液 （10~20 mL）放入一个刻度离心管（15~50 mL） 中，在2 000~4 000 r/min下离心5 min。细胞密实 体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。
48
(4)镁、钾、钙
到目前为止，几个报道已经表明，这些大量元 素是绝对必要的。有关这些元素如K＋的最适浓度 （胡萝卜为l mmol/L,矮牵牛和烟草为20 mmol/L)的 研究认为，不同培养物在吸收能力方面存在差异。 例如，在大豆等植物的培养中，在培养期间几乎所 有的K＋都被培养细胞所吸收；相反，在烟草的细 胞培养中，发现到了培养末期仍有最初浓度（20 mmol/L）的一半的K＋留在培养基中未被利用 （Kato等，,1977)。
5
为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方 法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜 培养基中（大约稀释5倍）。
6
滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长， 而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。
如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞 或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能 生长。
32
（二）抑制法
使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和 胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当 细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能 进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界 上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分 裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。
30
化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿，或 是通过加人某种生化抑制剂阻止细胞完成其分裂 周期。化学方法中常用的有饥饿法和抑制法两种。
植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法
植物细胞悬浮培养长期保存的简单而有效的方法Anne-Marie Boisson, Elisabeth Gout, Richard Bligny* and Corinne Rivasseau*摘要背景：植物细胞悬浮液每周反复的传代培养需要大量的劳力，并且增加子代细胞的变异率。
大多数的细胞保藏规程是基于冷冻和解冻的控制，存储在液氮中。
然而，细胞解冻后的存活率是不确定的。
植物细胞培养的长期存储和再生依然是一个重点。
结果：美国梧桐（Acer pseudoplatanus）和拟南芥细胞在不含磷酸盐的营养培养基上悬浮培养，5℃下细胞保存时间超过6个月。
通过数小时测量气体交换监测细胞活力的恢复和利用细胞体内外13C、31P代谢的核磁共振分析，表明细胞生长的重启并没有明显的延迟，也没有观察到可测量的细胞死亡。
结论：我们提供了一个保护生理上同源的植物细胞培养的简单方法，而不需要通过数月的传代培养。
基于细胞生长的阻碍和培养温度低的这个方案对于异养和半自养的细胞是有效的。
并且应该用来改善这项研究外的细胞株。
它不需要专门的设备，适合常规实验室使用。
关键词：植物细胞悬浮液美国梧桐拟南芥细胞保藏体内和体外的核磁共振光谱低温磷饥饿背景孤立的植物细胞悬浮培养是极具价值的方法，为高通量的研究提供素材，如代谢分析、二级植物产品的生产和除草剂的发现。
它使在细胞生理和生化同源性整体上的实验变得容易。
在液体营养培养基（NM）上大量培养植物细胞的各种不同方法已经被描述了的很长时间[1-4] 。
这种方法是基于当大部分最初添加到营养培养基的营养物质，特别是碳水化合物，代谢完时细胞悬液的传代培养已经达到稳定状态。
这将导致或多或少的同源细胞群体，并且常诱导一个继传代培养之后的生长延迟（滞后期）[5]。
这显示为获得同源细胞悬浮培养需要一些精密仪器，如用来优化营养培养基和进行细胞培养的恒化器[6]。
另外，每传代培养一天或者两天同样可以获得同源细胞群[7]。
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植 物 细 胞
培
养
技
术
植物细胞培养的过程：
愈伤组织 或其它分散细胞 继代培养 细胞群体 扩大培养 发酵技术
单个 悬浮培养 细胞 悬浮细胞
筛选 优良的 无性繁殖系 细胞代谢产物 分离提纯
1、单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞
由培养组织（如愈伤组织） 中分离单细胞
叶片是分离单细胞的最好材料
• 细胞次级代谢产物： • 植物生长到一定时期，由次 级代谢产生的一类细胞生命活动 或生长发育正常进行的非必需的 不分子有机物。
5、继代培养最佳继代时期：
选择指数生长期和直线生长期。
细胞生长曲线：呈S形曲线 1 2
培 养 细 胞 数 目
滞后期 （微生物又叫适应期）
5
4 3
1 2
指数生长期 （微生物又叫对数期）
3 直线生长期 4 5
培养时间
减慢期
静止期 （微生物又叫稳定期）
• 6、植物细胞培养的意义：
• 1）不受地理、季节和气候条件的限制； • 2）节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提 高经济效益；不污染环境 • 3）可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物； • 4）可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志 进行； • 5）可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以 进行特定的生物转化获得新的有用物质。
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
1 诱导产生愈伤组织 2 愈伤组织反复继代，使组织 不断增殖，提高愈伤组织的松 散性；
继代
悬浮
摇床用于振荡
3 悬浮培养：将愈伤组织 在液体培养基中培养，建立 优点：细胞团成小 细胞团或单细胞； 悬浮培养物 在培养基中均匀分 布；有空气交流。
愈伤组织
悬浮培养
4、悬浮继代培养
分批培养 连续培养
分批培养
继代
连续培养 加入培养基
二者体积相等
排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养 封闭式连续培养
切取 形成层 移栽
无菌 接种
脱分化
诱导愈伤组织成
植 物 组 织 培 养
6 5
再分化
(愈伤组织) 4 脱分化
1
3
2
脱分化
就是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去 其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的 过程。
脱分化的实质和结果分别是什么？ 实质是恢复细胞的全能性过程。 结果是形成愈伤组织。
当细胞分裂素和生长 素共同使用时，能刺激 愈伤组织的形成，而通 过调节二者的浓度比， 就可以调控植物细胞培 养过程中芽和根的形成， 称为“激素杠杆”。
生 长 素
根 芽
细胞分裂素
在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和 实验人员的无菌操作？
植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成 分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以 在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象 经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌 不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程 中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速 死亡。
愈伤组织
原指植物体受伤时产生 于伤口周围的组织。现 多指切取植物体的一部 分，置于含有生长素和 细胞分裂素的培养液中 培养，诱导产生的无定 形的组织团块。
菠萝的愈伤组织
愈伤组织的特点 排列疏松、高度液泡化的无定形状态薄壁细胞团 再分化： 脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分 化成根或芽等器官的过程。