常用的临床免疫学检测技术

常用的临床免疫学检测技术

第一讲免疫浊度技术

一、免疫浊度法基本原理

免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。

二、免疫比浊法的特点：

1、自动化免疫分析稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高（CV<5%)，干扰因素少，结果判断更加客观、准确，也便于进行室内及室间质量控制。

2、自动化免疫分析快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约大量人力物力，利于大批量样品的处理。

3、自动化免疫分析能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。

4、自动化免疫分析可利用多道计数器、测光仪，同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析项目，血清用量少，具有明显的应用优势。

三、免疫浊度法分类

（一）透射光免疫浊度法

透射光免疫浊度法是个极简便的方法，测定方式是测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减，读数以吸收光单位（A）或OD表示，这种A值反映了入射光和透射光的比率。

（二）散射比浊法

散射比浊法应用越来越多，且有替代其他免疫定量法的趋势。散射比浊的原理是根据雷利(Rayleigh)公式提出的，当复合物较小时（<3*10）呈全透射，透射与散射相当。当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射，在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表复合物的量。

1、终点散射比浊法

2、速率散射比浊法

速率法的灵敏度与特异性都优于终点法，前者的灵敏度比后者高出3个数量级之多，但终点法稳定性好。所谓速率，是在某单位时间内形成大于3*10以上的复合物量（不是积累数），当仪器测定到某一时间单位内形成的速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低，即代表抗原的量。

速率散射比浊法有三大特点：

1、时间快，一般在30-60s之内就可完成测试；

2、比较准确，因其测定形成速率，抗原多，

速率快；

3、节省试剂。

（三）粒子强化免疫浊度测定法

粒子强化免疫浊度测定法的基本原理是，选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后，当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。

四、免疫比浊法的临床应用

（一）检测项目

1、免疫功能监测：免疫球蛋白G、A、M，免疫球蛋白轻链κ、λ，补体C3、C4测定。

2、心血管疾病监测:载脂蛋白A、B，脂蛋白(a)，C-反应蛋白等。

3、炎症状况监测:C-反应蛋白，a-酸性糖蛋白，触珠蛋白，铜蓝蛋白等。

4、风湿性疾病检测：ASO、RF、CRP

5、肾脏功能检测：尿微量白蛋白，a-微球蛋白，β-微球蛋白，转铁蛋白，免疫球蛋白G等。

6、营养状态监测：白蛋白，前白蛋白，转铁蛋白等。

7、凝血及出血性疾病的检测：抗凝血酶Ⅲ，转铁蛋白，触珠蛋白等。

8、血脑屏障监测：脑脊液白蛋白，免疫球蛋白G、A、M。

（二）免疫浊度法测定中应注意的问题

1、伪浊度的影响

伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。

2、非特异性散射光的影响

免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗体组分在3％以下，散射比浊法需保证在0.5％以下。

3、钩状效应的影响

钩状效应存在于各种免疫测定方法中，在免疫浊度测定中也十分明显。现在很多仪器已具有检查钩状效应的功能，一经发现便可对样品稀释后复测。当病人症状与检测结果明显不符时，应怀疑其存在。

第二讲固相酶免疫测定技术

一、固相酶免疫测定的原理和类型

（一）ELISA的原理

基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应的结果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：1、固相的抗原或抗体；2、酶标记的抗原或抗体；3、酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。