实验十DNA的限制性内切酶酶切

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限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法

DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。

梳子干净晾干有利于梳孔的形成。

2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。

3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。

二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。

瓶子。

因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。

保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。

倒胶时尽量减少气泡的产生。

可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。

梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。

不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。

用枪头赶掉气泡。

高，导致背景太深。

摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。

高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。

4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。

时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。

5.拔梳子，放入电泳槽。

缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。

暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。

电泳液要浸没胶1mm。

三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。

质粒dna酶切实验报告

质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。

实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。

限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。

实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。

2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。

3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。

4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。

实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。

每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。

实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。

通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。

如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。

2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。

如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。

如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。

3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。

酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。

如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。

实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。

这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。

dna酶切实验报告

dna酶切实验报告DNA 酶切实验报告一、实验目的本次 DNA 酶切实验的目的在于掌握 DNA 酶切的基本原理和操作方法，了解限制性内切酶的特性和作用，通过对特定 DNA 片段的酶切，为后续的分子生物学实验如 DNA 连接、克隆和基因分析等提供基础。

二、实验原理DNA 酶切是一种分子生物学技术，基于限制性内切酶对特定 DNA序列的识别和切割作用。

限制性内切酶能够识别双链 DNA 分子中特定的碱基序列（通常为 4 8 个碱基对），并在特定的位点进行切割，产生具有粘性末端或平末端的 DNA 片段。

不同的限制性内切酶具有不同的识别序列和切割方式。

在本实验中，我们使用了具体限制性内切酶名称，其识别序列为具体序列，切割后产生粘性末端/平末端。

三、实验材料与设备1、实验材料待酶切的 DNA 样品（如质粒 DNA 或基因组 DNA）限制性内切酶酶的名称及来源酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液DNA 分子量标准2、实验设备移液器恒温培养箱电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、准备酶切反应体系按照实验要求，在无菌的离心管中依次加入适量的 DNA 样品、限制性内切酶、酶切缓冲液和无菌去离子水，使总体积达到具体体积。

轻轻混匀反应体系，短暂离心使液体集中在管底。

2、酶切反应将离心管放入恒温培养箱中，在设定温度下孵育反应时间。

3、终止酶切反应取出离心管，加入适量的上样缓冲液终止反应。

4、琼脂糖凝胶电泳制备浓度的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液。

将酶切产物与 DNA 分子量标准分别加入凝胶的加样孔中。

接通电源，以电压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移到适当位置。

5、凝胶成像观察电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中观察并拍照，记录酶切结果。

五、实验结果与分析1、电泳结果通过凝胶成像系统观察到清晰的 DNA 条带。

DNA 分子量标准呈现出预期的条带分布，用于估计酶切产物的大小。

酶切后的 DNA 样品显示出与预期相符的片段大小，表明酶切反应成功。

DNA限制性内切酶酶切分析

DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。

限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。

与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。

把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。

如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。

把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。

进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。

特定的酶有其配套的缓冲液。

进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。

二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。

三、材料、试剂与器具1、DNA样品。

2、限制性内切酶。

3、10×限制性内切酶反应缓冲液。

4、无菌双蒸水。

5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。

6、10×TBE buffer。

7、琼脂糖。

8、溴化乙锭溶液。

9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。

10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。

11、10mg/ml Rnase。

四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。

2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。

用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。

4、在37℃温育60－120分钟。

DNA的酶切与连接1.实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用...

DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。

2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。

1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。

人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。

目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。

如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。

对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。

在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。

3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。

DNA的限制性内切酶酶切

DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。

2.了解限制性内切酶的特点。

实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。

根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。

绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。

实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。

实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。

（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。

（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。

实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。

（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。

（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。

注意事项（1）注意要在冰上操作。

（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。

实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。

思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。

ｄｎａ的限制性酶切反应

ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。

限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。

根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。

Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。

Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。

故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。

Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。

它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。

体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。

其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。

常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。

本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。

DNA 的限制性内切酶酶切分析

6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显绿色荧光条带，
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。（点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装

质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定

质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA 的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。

［实验原理］限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。

细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。

它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。

由于细胞每存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。

所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。

目前已发现的限制性内切酶有数百种。

EcoRⅠ和Hind Ⅲ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片断。

EcoRⅠ和Hind Ⅲ的识别序列的切口是：EcoRⅠ: G↓AATTCHind Ⅲ: A↓AGCTTG,A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

［实验器材］1.仪器和材料电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（100mL 或50mL），玻璃纸，一次性塑料手套。

pUC19（市售和自提），EcoRⅠ酶，λDNA- Hind Ⅲ酶切的分子量标准、琼脂糖。

2.试剂（1）TAE缓冲液（1×TAE）：称取Tris 4.9g、EDTA-Na2－2H2O0.74g，用900ml蒸馏水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml，最终用蒸馏水定容至1L。

生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析

实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。

它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。

根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶，如Eco RⅠ、BamHⅠ等，它们被誉为分子生物学家的手术刀。

临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点，因此当用一定的限制性内切酶切割时，产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异，因而发生DNA限制性酶切图谱改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析，观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。

经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。

【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1．DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。

2．限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。

3．10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。

酶切分析实验报告

一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。

2. 掌握质粒DNA的提取方法。

3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。

4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定目的DNA片段。

二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Endonucleases）是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。

在基因工程中，限制性核酸内切酶用于切割DNA分子，以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。

本实验中，我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

根据酶切位点的不同，质粒DNA会被切割成不同长度的片段。

通过比较酶切前后的DNA片段，可以鉴定目的DNA片段。

三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取：根据试剂盒说明书提取质粒DNA。

2. 酶切反应：将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合，加入缓冲液，进行酶切反应。

3. 琼脂糖凝胶电泳：- 准备琼脂糖凝胶，加入电泳缓冲液。

- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。

- 连接电源，进行电泳。

- 电泳完成后，关闭电源，取出凝胶。

4. 凝胶成像与分析：- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。

- 根据标准DNA分子量标记，分析酶切产物的长度。

- 比较酶切前后的质粒DNA片段，鉴定目的DNA片段。

五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取：成功提取出质粒DNA，通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。

2. 酶切反应：限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA，产生不同长度的片段。

3. 琼脂糖凝胶电泳：- 电泳结果显示，酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。

- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物，可以确定酶切位点的位置。

生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析

生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析摘要：DNA的限制性内切酶酶切分析是现代生物学和分子生物学中非常重要的一项研究技术，主要应用于DNA结构和功能以及遗传学和进化学等方面的研究。

本实验使用EcoRI和HindIII这两种限制性内切酶，对大肠杆菌的某一段DNA进行酶切，得到了预期的多个DNA 片段，并利用琼脂糖凝胶电泳对其进行分离和检测，结果表明，酶切后的DNA片段与预期大小基本一致，证明酶切反应成功。

关键词：DNA，限制性内切酶，酶切分析，琼脂糖凝胶电泳引言：DNA的限制性内切酶酶切分析是一种基于DNA序列差异的技术。

DNA序列不同，限制酶切割的位置也不同，因此，不同的DNA序列酶切后会生成不同大小的DNA片段。

这种技术可以用于DNA序列分析、构建基因工程载体、DNA指纹图谱的建立、遗传学分析等领域。

实验目的：1. 掌握限制性内切酶的性质和酶切反应的条件；2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；实验仪器和试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、蒸馏水、限制性内切酶EcoRI、HindIII、DNA Lambda/HindIII Marker。

实验步骤：1. 取0.1ml的大肠杆菌液体培养物放入1.5ml离心管内，离心10000r/min，去除细胞上清，加入200μl TE缓冲液（pH8.0），混匀。

2. 使用热澄清法将样品DNA被酶切（50℃下酶解1小时），收集酶切片段3. 为了预防酶切反应被停止，在样品DNA被酶切后立即在65℃下将反应体系加热10分钟，然后在4℃下保存至少10分钟；4. 准备琼脂糖凝胶，取0.8%琼脂糖溶液60ml，加入TAE缓冲液40ml，混合均匀后加入眼镜面板中，等待凝固；5. 将DNA样品与核酸标准品（控制）混合，电泳插板，然后加入注射器内的浓缩染料混合物。

6. 加电泳电源600V，电泳15分钟，至染料前端到达凝胶底部为止；7. 用止血酵素缓慢清洗文胸架，并用蒸馏水冲洗凝胶板表面，然后将凝胶板上的DNA 条带转移到薄膜上；8. 用紫外线辐射染色机染色（UV-28，365nm）。

DNA限制性内切酶——酶切Buffer组分及其活性

DNA限制性内切酶——酶切Buffer组分及其活性TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液(Universal Buffer) 测定限制酶活性的体系(5种通用缓冲液中，用标注的)，以此时的活性值作为100%。

并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。

有( ) 标记的是易受Star活性影响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用或标注的缓冲液。

每种限制酶都有其自身的基本缓冲液(Basal Buffer)，其中AccⅢ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、Cfr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、Psh BⅠ、Sna BⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11B Ⅰ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(Basal Buffer)。

各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。

各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。

限制酶在各种缓冲液中的相对活性附带·活性测定用Buffer 推荐使用的Buffer*1+0.01%BSA→100%:Afl II, Aor13H I, Eco O65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I *2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100→100%:Not I*3不加BSA按Universal Buffer分类的限制酶各Universal Buffer的组成■ 使用注意事项10×Buffer都为10倍浓度的缓冲液。

此外，10×T溶液中不含BSA，在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍浓度(0.1%) 的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。

DNA的限制性内切酶酶切分析

DNA的限制性内切酶酶切分析DNA限制性内切酶酶切分析（restriction enzyme digestion analysis）是一种常用的实验方法，用于分析DNA片段的长度及其在不同DNA样本中的存在与否。

本文将介绍DNA限制性内切酶的定义和分类、酶切分析的原理、实验步骤和结果的分析等内容。

DNA限制性内切酶（restriction enzyme）是一种能够识别特定的DNA序列并酶切它们的酶类。

它的发现和应用让分子生物学和遗传学研究取得了重要的突破。

限制性内切酶按照它们识别的DNA序列和酶切的方式可以分为以下几类：1. 四切酶（Type I）：这类酶不仅有切割DNA的酶活性，还有甲基转移酶活性。

它们通常是多亚基复合物，需同时与子基的甲基转移酶活性合作。

2. 六切酶（Type II）：这类酶是最常用的限制性内切酶，它们能够识别特定的DNA序列，并在识别序列中特定的位置切割DNA链。

这类酶可以以精确的方式酶切DNA，生成具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。

3. 四切酶（Type III）：这类酶也是多亚基复合物，通常需要其中一种辅助因子才能发挥酶切活性。

4. 五切酶（Type IV）：这类酶的酶切方式和高度特异性尚不清楚。

在酶切分析实验中，我们通常选用能够产生可检测到的DNA片段的限制性内切酶进行反应。

实验步骤如下：1.提取DNA样本：从要分析的细胞或组织中提取总DNA。

2. 选择限制性内切酶：根据需求选择一种适合的限制性内切酶。

常用的限制性内切酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。

3.DNA酶切反应体系的设置：配置适当的酶切反应缓冲液，加入所选的限制性内切酶和总DNA，进行适当的搅拌反应。

4.酶切反应的条件调整：根据所选酶切酶的最佳工作条件进行反应温度、反应时间等参数的调整。

5.停止酶切反应：加入适当的制动剂（如酶切反应停止缓冲液）终止酶切反应。

6.扩增和可视化：对酶切后的DNA样品进行聚合酶链反应（PCR）扩增或直接进行凝胶电泳检测，以确定DNA片段的长度和存在与否。

DNA的限制性酶切实验原理

分别加入DNA 5μl， 10×缓冲液2μl,BSA 2ul，EcoRI 1ul， ddH2O 10ul，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１２小时即可，充分酶解。
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Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能

实验八_DNA的限制性内切酶酶切和鉴定

025溴粉蓝40wv蔗糖水溶液贮存于溴化乙锭eb溶液六操作步骤将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管最好05ml编号用微量移液枪分别加入质粒dna514相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l再加入重蒸水使总体积为18l将管内溶液混匀后加入ecorihind各1l用手指轻弹管壁使溶液混匀也可用微量离心机甩一下使溶液集中在管底
5´GAATTC EcoRⅠ CTTAAG 5´
AAGCTT HindⅢ 5´ TTCGAA5 5´

质粒pUC18的物理图谱的物理图谱质粒
三、材料
重组质粒； EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose) 。四、仪器移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA （5---14 µl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2µl,再加入重蒸水使总体积为 18µl, 将管内溶液混匀后加入 EcoRI 和 HindⅢ 各1µl,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量 d 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、每管加入2µl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。