高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A
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高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A
摘要针对谷物及其制品可能污染的霉菌毒素——赭曲霉毒素A,用免疫亲和柱净化高效液相色谱法进行了验证。
关键词赭曲霉毒素A;高效液相色谱法;谷物及其制品;OchraTest免疫亲和柱
赭曲霉毒素A是曲霉属和青霉属一些菌种的有毒产物,动物毒性试验表明,赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神经毒性、致畸性及致癌性。1993年,国际癌症研究中心已将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。被赭曲霉毒素A污染的谷物及其制品是人体内赭曲霉毒素A的主要来源,通过对谷物及其制品中赭曲霉毒素A的检测可以估计人体每天摄入量。目前国际上检测赭曲霉毒素A的方法有薄层层析法、酶联免疫吸附法及高效液相色谱法等,高效液相色谱法是最常用的方法。本文验证了用高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A含量的方法,现报告如下。
1材料与方法
1.1试验原理
将试样与提取溶液混合后高速均质、过滤得到提取液,提取液经稀释后加入到装有赭曲霉毒素A专一化抗体的免疫亲和柱中,使样品中的赭曲霉毒素A与抗体结合。淋洗除杂质后,以甲醇洗脱溶液使赭曲霉毒素A与抗体分离洗脱,供液相色谱定性定量测定。
1.2材料与设备
1.2.1材料。色谱纯已腈、纯水、乙酸、磷酸盐缓冲液、色谱纯甲醇、折叠滤纸、微孔玻璃纤维滤纸、赭曲霉毒素A标准品。
1.2.2设备。OchraTest免疫亲和柱,Agilent1100液相色谱仪(带有荧光检测器),高速均质机,手动玻璃注射器泵流架,电子天平(感量1g),谷物粉碎机。
1.3样品测定方法
1.3.1提取。称取50g磨细的样品,置于搅拌杯中,加入100 mL乙腈水溶液(乙腈∶水=60∶40),盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌1min,取下盖子,将提取物倒入槽纹滤纸上,滤液收集于干净的容器中。
1.3.2提取物的稀释。移取10mL上步的滤液,置于干净的容器中,用40mL纯水将滤液稀释、混匀,将上步稀释液通过玻璃微纤维滤纸过滤器,滤液收集于玻璃注射器筒中。
1.3.3分离柱色谱操作。将上步10mL滤液以1~2滴/s的流速全部通过OchraTest免疫亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。将10mL磷酸盐缓冲液以1~2滴/s的流速全部通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。将10mL纯水以1~2滴/s 的流速全部通过亲和柱,直至空气进入到亲和柱中。用1.5mL色谱纯甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱,收集全部淋洗液与2mL小瓶中,供测试用。
1.3.4测定。液相色谱条件:色谱柱流速:1mL/min;柱温:30℃;检测波长:激发波长333nm,发射波长477nm;流动相为水∶乙腈∶乙酸=99∶99∶1;进样量:30μL。
1.3.5液相色谱测定。赭曲霉毒素A不同浓度标准溶液的液相色谱出峰面积线性关系见表1,赭曲霉毒素A标准品的液相色谱图见图1。
1.3.6计算方法。样品中赭曲霉毒素A(μg/kg)=C×V/m,其中,C为液相色谱仪测得的样品溶液的浓度,μg/L;V为样品溶液的定容体积,mL;m为样品质量,g。
2结果与分析
2.1流动相的选择
在其他色谱条件不变的情况下,分别用甲醇∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)、乙腈∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)2种溶液作流动相,赭曲霉毒素A标准溶液浓度5ug/L,进样30μL。试验表明,甲醇∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)流动相在30min内无色谱峰出现,乙腈∶水∶冰乙酸(99∶99∶1)流动相在 6.7min出峰,且被测组分有较高的灵敏度,所以选用了后一种溶液作流动相。
2.2回收率与精密度
2.2.1回收率试验。在面粉样品中分别加入浓度为0.8μg/L、4.0 μg/L的赭曲
霉毒素A标准溶液,回收率分别是82.0%、96.3%。
2.2.2精密度试验。取分别加入5μg/L、10μg/L赭曲霉毒素A标准溶液的3个样品,每份样品3个平行样,在相同条件下连续每份样品6次重复测定,每份样品测定18次,分别计算各种浓度测定结果的相对标准偏差(RSD),其结果为9.21%和7.58%。
3结论
免疫亲和柱净化高效液相色谱法测定谷物中赭曲霉毒素A不仅测定灵敏度高,准确可靠,而且快速、经济、实用。