蛋白质的时间分辨荧光动力学及其在NADHNAD~+比率定量测量中的应用

蛋白质的时间分辨荧光动力学及其在NADH/NAD~+比率定量测量

中的应用

现代生物学领域中,对蛋白质结构与功能的研究一直是学术界关注的热点和焦点。荧光探测技术因其高灵敏性且能够在分子尺度上提供生物化学相互作用的信息而被广泛应用于相关领域的研究之中。时间分辨荧光作为荧光探测技术重要的组成部分,相较于稳态荧光具有更高的灵敏度和分辨率,近年来国内外学者对此方法的关注和研究深度不断加大,本文的研究便集中于此。通过使用时间分辨荧光方法,本文首先对LicT蛋白和SNase变体的荧光动力学过程进行了深入的探讨,研究了其与蛋白质结构的关系。

在此基础之上,本文使用了基因编码的荧光蛋白生物探针,依据时间分辨荧光动力学原理,提出了一种高灵敏的NADH/NAD+比率定量方法。与此同时,依据相同的实验技术和理论基础,本文还提出了一种环状排列黄色荧光蛋白探针去除pH值效应的NADH定量方法。本文研究内容的第一部分由两方面构成,主要使用时间分辨荧光方法,并结合紫外吸收光谱和稳态荧光光谱对LicT蛋白和SNase 变体的色氨酸残基进行荧光动力学研究。一方面,本文通过荧光发射和色氨酸残基寿命的差异,确定活化型LicT蛋白AC 141和野生型蛋白Q 22具有不同的结构特性。

多指数的荧光寿命说明了色氨酸残基微环境和淬灭现象。在此基础上,通过衰减相关(DAS)和时间分辨发射光谱(TRES)说明了两种蛋白色氨酸残基和极性溶剂水的相互作用,并且活化型AC 141结构比野生型Q 22更为紧实。此外,蛋白质中色氨酸残基的TRES表示了连续弛豫的过程。色氨酸残基的各向异性说明了色氨酸在蛋白质系统中具有独立的局部运动,活化型AC 141的运动更加强烈。

总之,内源性色氨酸可以用作研究活化前后LicT蛋白局部微环境和结构变化的探针,为进一步探索皮秒量级级的LicT蛋白荧光动力学性质提供依据。另一方面,本文主要使用时间分辨荧光方法,结合紫外吸收谱和稳态荧光光谱对葡萄球菌核酸酶(SNase)两种变体Δ+PHS和Δ+PHS+I92A的色氨酸残基荧光动力学进行了探究。两种变体的稳态荧光光谱表明SNase螺旋结构对色氨酸残基的保护作用。衰减相关光谱(DAS)随温度变化的不同趋势表明两种变体的折叠及热稳定性各不相同。

时间分辨发射光谱(TRES)中色氨酸残基0.5 ns的连续光谱弛豫过程印证了SNase变体的折叠结构紧密程度不同。上转换分析结果则表明了色氨酸残基受弛豫效应的影响。各向异性分析结果对残基和整个SNase变体的结构变化进行了阐述,说明色氨酸残基在蛋白质体系内有独立的局部运动,且其强弱与SNase的热

稳定性和热运动的整体效果有关。因此,色氨酸可作为一种内源性探针对SNase

变体的折叠结构和热稳定性进行印证和研究。

除此之外,这些结论为使用时间分辨荧光方法进一步探索其他SNase变体的结构动力学性质提供了依据。在蛋白质荧光动力学的研究基础上,使用相同的实验方法和理论基础,本文研究内容的第二部分研究了基因编码荧光探针Peredox、SoNar、Frex的NADH/NAD+定量方法,提出了基于荧光寿命部分强度的比率定量法。通过时间分辨荧光方法的测量和分析可以看出,当NADH/NAD+氧化还原状态改变时,探针的寿命成分(τi)几乎保持恒定,而它们各自的部分振幅(αi)发生改变。最重要的是,由于探针在两个不同状态之间存在结构变化,部分强度(ατi)在探针与NADH结合的过程中具有相反的变化趋势,其比率可以用于NADH/NAD+的定量。

这种方法与常用的稳态荧光强度和平均寿命方法相比,具有更大的动态范围和更高的分辨率。此外,该比率测量法仅需要一个激发和一个发射波长,消除了传统的激发比率法和发射比率法存在的问题。本文提出的NADH/NAD+新型比率定量方法,可用来简化基因编码荧光蛋白探针的设计,并且用这些探针实现高度灵敏

的分析物定量。这种新方法可以广泛应用于活细胞的代谢成像。

与此同时,本文还提出了一种环状排列黄色荧光蛋白探针去除pH值效应的NADH定量方法。该方法仅使用单个激发波长,用时间分辨荧光手段得到的寿命成分及其比重对NADH进行定量。这种方法有望用于活细胞氧化还原水平的成像中。综上,本文使用时间分辨荧光技术研究了蛋白质体系的动力学过程和NADH/NAD+

荧光蛋白探针部分强度的比率定量方法。

首先探讨了 LicT蛋白活化前后的结构变化和SNase蛋白折叠结构和热稳定性,为之后蛋白功能与结构的研究提供了新的思路。在此基础之上,又对荧光蛋白探针的荧光动力学过程进行了研究,提出了高灵敏的NADH/NAD+时间分辨比率定

量方法和去除pH值效应的NADH定量方法,为活体细胞氧化还原状态的监测提供了新的方向。