荧光定量PCR引物设计

荧光定量PCR引物设计

专业的定量PCR设计软件：beacon Designer

有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关

看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效

看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。

看所用扩增基因是否为组织特异性表达

看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整

设好内参正对照

最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，

（1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率

（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染

（3）两条引物的Tm值不要相差太大

（4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般T m=80以下的峰都是引物二聚体），对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值和内参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。

（3）相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3'端不要有错配。

（5）一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之内可以搞定一个基因。

实时定量PCR引物设计的具体要求

1、引物使用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的

300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。

2、不能形成2级结构。

3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。

4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。

5、碱基要随机分布，尽量均匀。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8、引物5‘端可以修饰。

9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域，避开T/C, A/G连续结构（2-3个）。

10、引物3'端要避开密码子的第三位。

11、引物整体设计自由能分布5'端大于3‘端。

12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。

实时定量PCR完全手册

方法简介

所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本和阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本和阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。

（4）内参法+过程监测。由于样本和阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参和物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。

（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。

在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。

所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：

（1）R Green I 检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。

（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。温度循环为94—60°C 二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料

的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。

（3）杂交探针（Hybridization Probes）模式。温度循环为94—55—72°C 三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号和特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。

RT-q PCR是由三个步骤组成:

1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;

2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;

3.检测:实时检测和定量扩增的产物.

RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):

1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计

2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性

3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-q PCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是和人类临床诊断分析相适应的。