紫甘薯色素通过抑制氧化应激介导的NLRP3炎症体的活化作用降低高脂饮食小鼠肾损伤

附录：文献翻译

紫甘薯色素通过抑制氧化应激介导的NLRP3炎症体的活化作

用降低高脂饮食小鼠肾损伤

摘要：

炎症体在肥胖的发病机制中起着关键作用。紫甘薯色素(PSPC)有潜在的抗炎功效。我们研究了紫甘薯色素在高脂肪饮食(HFD)引起的肾损伤中所起的作用,并探讨其根本机制。结果表明,紫甘薯色素(700毫克/公斤/天)降低了高脂肪饮食(60%的脂肪食物)喂养20周的老鼠中的尿白蛋白与肌酸酐、炎细胞渗透物的比例以及胶原IV积累。紫甘薯色素明显减少了肾NLRP3炎症体的表达水平，包括NLRP3和ASC、Caspase-1和导致IL-1β下降。而且,PSPC能抑制IKKβ和NF-κB的活性。此外,PSPC能够降低NLRP3炎症体上游的氧化应激AGE受体(RAGE)和硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的表达水平。这些数据表明：在高脂肪饮食引发的肾功能紊乱和损伤中PSPC的有效作用是通过NLRP3信号途径介导的，也提出了肥胖的预防的潜在指标。

关键字：PSPC HFD NLRP3炎症体氧化应激肾损伤

1、引言

炎症作为器官损伤的一个主要原因，在各种代谢紊乱疾病的病理过程中起着至关重要的作用,如痛风、坏血病、糖尿病酮症酸中毒。新的证据表明,炎症体介导的肾脏损伤涉及肥胖症的发病机理。最近,一些研究表明：长期过度食用如高脂肪饮食(HFD)的食物会在不同组织中产生免疫性的细胞渗透物,这些物质从而导致炎症基因表达产物的生成，包括细胞因子、趋化因子以及其他介质,这些产物在氧化应激和炎症反应中与肥胖息息相关。HFD引起的NLRP3炎症的活化作用和它上游或下游信号分子的改变,如NF-κB和RAGE,这些物质参与肥胖的过程,导致肾损伤和胰岛素抵抗。此外,与炎症相关的基因的操纵可以预防和逆转HFD 引起的肾脏损害。例如,传统大豆发酵的豆酱产品和清麴酱通过抑制HFD饲养的老鼠的炎性蛋白的NF-κB相关活动来减弱肾脏炎症反应,药用植物木兰花提取物（BL153）通过降低HFD处理的小鼠的炎症标记物的肿瘤坏死因子-α（TNF-a）

和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达来改善尿蛋白和肾结构。总的来说，天然产品有助于减弱由HFD引起的肾损伤，然而，新的天然产品和它们的保护机制仍然需要去证明。

紫甘薯色素（PSPC）是一种花青素，它是一种天然的稳定的多酚类色素，并且可以直接被吸收到血液中而无细胞毒性。新的研究表明，PSPC通过其体内有效的抗氧化活性在预防不同的炎症引起的疾病中具有潜在的功效。在我们实验室以前的数据中已经表明：PSPC通过改善D-半乳糖介导的衰老小鼠的大脑或肝脏的氧化性损伤和炎症反应能显著地改善学习记忆或肝损伤。最近发现，PSPC是通过由AMPK信号传导抑制减少肝脏炎症以加速改善HFD介导的小鼠肥胖症的预防和治疗，或通过阻断NF-κB信号提高肝胰岛素敏感性。这些结果表明，PSPC 在代谢组织中的保护机制与肥胖症息息相关，如肾代谢组织中，该保护机制可以加速肥胖症的治疗进程。在本研究中，我们通过测定氧化应激和炎症反应来研究控制PSPC的HFD饲养的小鼠的肾脏反应，以及通过测量在保护过程NLRP3炎症体的作用来研究PSPC预防肾损伤的调控机制。

2、材料和方法

2.1动物处理

从啮齿动物国家饲养中心中国北京分公司购买八周龄雄性ICR系小鼠（32.12±2.14克）。小鼠生活在恒定温度（23±1℃）、湿度（60％）、光照与黑暗时间都为12h的日周期（光照时间：8：00-20：00）以及给予小鼠可自由获取的食物和水的实验室里。这种条件下驯化一周后，将小鼠随机分为四组：控制组，HFD，HFD/PSPC，PSPC。选择脂肪含量为11.4％的普通饮食或脂肪含量为60％的HFD喂养小鼠。此外，如前人(Zhang et al.,2013)描述的一样，通过口服喂养法以每天700毫克/千克PSPC的剂量或它的溶剂（0.1％吐温为80的水溶液）处理小鼠。（PSPC包括两个主要成分：花青素苷酰和甲基花青素酰苷（含量>90％）（中国青岛鹏远天然色素研究所））。实验中的所有程序符合实验动物使用和照顾的中国法例，并且动物实验已得到具有代表性的大学委员会的认可。20周后，处死小鼠，肾组织用于实验或储存在80℃下备用。

每四周禁食6h后测量小鼠的体重，24小时后，从生活在代谢笼中的小鼠中收集尿样，检测其尿肌酐和尿蛋白含量。

2.2尿中白蛋白和肌酸酐的测定

药物治疗小鼠后，尿蛋白的分泌是利用尿白蛋白与肌酐24小时的尿液收集比（ACR）。尿肌酐和白蛋白的浓度是使用商业试剂盒（中国南京建成生物技术研究所提供）进行评估。通过UV2501检测其吸收值。

2.3葡萄糖和胰岛素耐受性试验

小鼠经20周的饮食干预之后，分别进行葡萄糖耐受性试验和胰岛素耐受性试验。以5g/kg的葡萄糖口服治疗禁食12小时的小鼠进行葡萄糖耐受性试验，然后分别在30、60、90和120分钟时立即检测其血糖值。对于胰岛素耐受性试验，是在禁食的小鼠腹腔注射1U/kg的胰岛素，然后分别在30、60、90和120分钟时立即检测其血糖值。血液样品是通过尾静脉穿刺获得，血糖是通过Ascensia精密血糖仪进行检测。

2.4组织学评价

小鼠心脏灌注0.9％无菌盐水100ml，立即取出肾脏组织并固定在pH7.4的4％多聚甲醛的新鲜溶液中在4℃下4小时，然后分别在含15％，20％，和30％蔗糖的100mM磷酸钠缓冲液（PH7.4）、4℃条件下培养过夜；并插入最佳切割温度（OCT）化合物。12μM冷冻切片在3--氨丙基--三甲氧基硅烷包被的载玻片上收集。肾切片用苏木精和伊红染色，并由对动物接受治疗类型视而不见的肾脏病理学的一个专家进行测量。

免疫组织化学染色是通过以下市售的试剂盒进行（中国北京中山金桥生物技术提供）。首先，用3％H2O2处理10分钟阻断组织切片中内生过氧化物酶的活性，并用5％羊血清处理1小时而阻断非特异性结合位点。然后，切片用兔抗胶原IV（胶原IV，1：200，圣克鲁斯生物技术）在4℃条件下培养过夜。并且，加入生物素化山羊的抗兔IgG二抗体培养20分钟。最后，抗生物素蛋白山萝卜过氧化物酶（生物素）处理20分钟。山萝卜过氧化物酶催化DAB和过氧化氢反应5分钟至产生黄色沉积物。该染色切片用蒸馏水洗涤并用水或中性树脂密封。染色切片用莱卡200显微镜（莱卡4000，德国）捕获。

2.5组织匀浆

对于生化分析，小鼠深度麻醉并杀死。立即分开其肾组织并用10冲程1200转的波特匀浆器（Kontes，Vineland，NJ，USA）在冰冷的1/10（w/v）的50mM 磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.2）中使其均质化。组织匀浆在12000g条件下离心10分钟，得到上清液，用于检测晚期糖基化终产物（AGEs）和活性氧（ROS）的水平。

对于活性氧试验，肾脏组织匀浆用冰冷的洛克的缓冲液（154mM氯化钠，5.6mM的氯化钾，3.6mM碳酸氢钠，2.0mM氯化钙,10mM D-葡萄糖，5mM4-（羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，pH7.4）按1:20（体积比）稀释，得到浓度为5毫克组织/毫升的组织匀浆溶液。

对于蛋白质印迹分析，肾脏组织在1/5（重量/体积）冰冷的细胞裂解缓冲液（25mM HEPES，PH值7.4，125mM氯化钠，的25mM氟化钠，1mM EDTA，1mM乙