研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定
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(4) 不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质 粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。
14
1.4 理想的克隆载体：
(1) 分子质量小、多拷贝、松弛控制型；
(2) 具有多种常用的限制酶的单切点；
(3) 能插入较大的外源DNA片段；
(4) 具有容易操作的检测表型。
15
15
1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
8
1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对 质粒分子的降解作用。（保护作用）
③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作
质粒DNA的制备 限制性内切酶切割重组质粒
朱文博 中山医学院
基因克隆
• 定义：
经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通 常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
基因工程
• 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为基因工程，又称重组DNA技术。
• 基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
高碱
②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的：
★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。
U6启动子 （256bp）
BamHI
5'-G A A T T C-3‘ 3'-C T T A A G-5' Hind III
5'-A A G C T T-3' 3'-T T C G A A-5'
电泳检测
2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
28
PUC119 （3.2Kb）
BamHI 双酶切
Hind III 重组质粒（PUC119-U6）
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
12
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的基本特征：
(1) 自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；
(2) 可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝
松弛型复制-复制数十个拷贝；
(3) 可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移
到另一个宿主细胞；
9
1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
10
(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
11
(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
1.1 定义
能识别DNA的特意序列（酶切位点），并在此位 点或周围催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性 DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
25
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
实验内容
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
33
思考题？
• 为什么要用双酶切而不是单酶切割重组质粒DNA？
34
＋
目的基因
接
宿主细胞
＋
重组体
转
百度文库
已转化的宿主细胞
繁殖
筛
阳性克隆株
表达
基因载体
基因工程中常用的载体(vector)主要包括
质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)
柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致 病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行 筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） (2)细菌的收集与裂解 • 收集方法：高速离心的方法 • 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 • 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
• (1) 保证核酸一级结构完整 • (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA
3.1 实验原理：
细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；
用）
21
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)
① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
22
溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS
复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
加1.4ml培养物于1.5mlEP管，12000rpm×1min，去上清， 3.3 实 加入冰的200µl 溶液I(保护溶液)，剧烈振荡EP管重悬细菌，室温放置3min 验 加入200µ l 溶液II(高碱)，快速颠倒数次，冰浴3min (不要剧烈振荡！) 步 骤 加入150µl 冰溶液III(高酸)，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min 转移上清500µ l到新EP管，加入等体积500µ l的酚与氯仿/异戊醇的混合物(1:1 混合)，充分颠倒混匀，12000rpm×5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入等体积400µ l氯仿/异戊醇，颠倒混匀， 12000rpm5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800µ l无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000rpm10min
31
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
32
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计
20μl
实验步骤：将10 μl 质粒DNA加入已装有反应缓冲液的 0.2ml EP管，置于已调成37 ℃的PCR仪反应 2h； 余下10 μl DNA保存于-20℃冰箱待做转 化与筛选实验。
弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，颠倒混匀，12000rpm×5min 去上清，管平放室温静风干， 20 µ l TE 溶解DNA，其中10 µ l加入酶切反应 管，置于PCR仪37度反应2h，余10 µ l置于-20度冰箱保存
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）
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1.4 理想的克隆载体：
(1) 分子质量小、多拷贝、松弛控制型；
(2) 具有多种常用的限制酶的单切点；
(3) 能插入较大的外源DNA片段；
(4) 具有容易操作的检测表型。
15
15
1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
8
1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对 质粒分子的降解作用。（保护作用）
③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作
质粒DNA的制备 限制性内切酶切割重组质粒
朱文博 中山医学院
基因克隆
• 定义：
经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通 常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
基因工程
• 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为基因工程，又称重组DNA技术。
• 基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
高碱
②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的：
★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。
U6启动子 （256bp）
BamHI
5'-G A A T T C-3‘ 3'-C T T A A G-5' Hind III
5'-A A G C T T-3' 3'-T T C G A A-5'
电泳检测
2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
28
PUC119 （3.2Kb）
BamHI 双酶切
Hind III 重组质粒（PUC119-U6）
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
12
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的基本特征：
(1) 自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；
(2) 可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝
松弛型复制-复制数十个拷贝；
(3) 可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移
到另一个宿主细胞；
9
1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
10
(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
11
(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
1.1 定义
能识别DNA的特意序列（酶切位点），并在此位 点或周围催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性 DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
25
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
实验内容
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
33
思考题？
• 为什么要用双酶切而不是单酶切割重组质粒DNA？
34
＋
目的基因
接
宿主细胞
＋
重组体
转
百度文库
已转化的宿主细胞
繁殖
筛
阳性克隆株
表达
基因载体
基因工程中常用的载体(vector)主要包括
质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)
柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致 病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行 筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） (2)细菌的收集与裂解 • 收集方法：高速离心的方法 • 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 • 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
• (1) 保证核酸一级结构完整 • (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA
3.1 实验原理：
细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；
用）
21
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)
① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
22
溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS
复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
加1.4ml培养物于1.5mlEP管，12000rpm×1min，去上清， 3.3 实 加入冰的200µl 溶液I(保护溶液)，剧烈振荡EP管重悬细菌，室温放置3min 验 加入200µ l 溶液II(高碱)，快速颠倒数次，冰浴3min (不要剧烈振荡！) 步 骤 加入150µl 冰溶液III(高酸)，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min 转移上清500µ l到新EP管，加入等体积500µ l的酚与氯仿/异戊醇的混合物(1:1 混合)，充分颠倒混匀，12000rpm×5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入等体积400µ l氯仿/异戊醇，颠倒混匀， 12000rpm5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800µ l无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000rpm10min
31
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
32
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计
20μl
实验步骤：将10 μl 质粒DNA加入已装有反应缓冲液的 0.2ml EP管，置于已调成37 ℃的PCR仪反应 2h； 余下10 μl DNA保存于-20℃冰箱待做转 化与筛选实验。
弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，颠倒混匀，12000rpm×5min 去上清，管平放室温静风干， 20 µ l TE 溶解DNA，其中10 µ l加入酶切反应 管，置于PCR仪37度反应2h，余10 µ l置于-20度冰箱保存
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）