研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定
质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定一、实验目的1. 学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA 的方法；2. 学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3. 学习并掌握紫外吸收检测DNA 浓度和纯度的原理和方法；4. 学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5. 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1. PCR（多聚酶链式反应）在DNA 聚合酶催化下，可以DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCF一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至95C，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35-70C, —般低于模板Tm值的5C 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。
C. 延伸：溶液反应温度升至中温72C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2. 质粒DNA 的提取与制备（1）. 碱裂解法：染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒DNA 均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（2）.离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B. 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C. 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3. 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C. A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA 纯净A260/A280V1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验三 质粒DNA的提取与酶切
相对误差2～5％ 操作简便快速 应用广泛
光学光谱区
远紫外
（真空紫）
近紫外 可见
近红外
中红外
远红外
10nm~200nm 200nm ~380nm
380nm 780 nm ~ 780nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
复合光 氢灯 可见光分光光度计光源 （阳光及钨灯） 紫外分光光度计光源 三棱镜
实 验 三
重组质粒DNA的提取、酶切鉴定及电泳检测
紫外分光光度法检测DNA
实验安排
上午：
质粒DNA提取 限制性内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶制备
下午：
酶切产物的电泳 紫外分光光度法检测DNA 实验课题设计的要求与安排
问
题
1 提取质粒DNA和提取基因组DNA有何不同?
2 限制性内切酶与医学有何关系?
试剂：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂
仪器与设备：电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、
烧杯、吸管、微量移液器
3.实验方法和步骤
方法：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
步骤： 试剂准备
制胶 样品处理 电泳 染色与脱色
4.实验观察指标 ① 聚丙烯酰胺凝胶上电泳区带的分布 ② 电泳区带颜色深浅
5.实验预期结果的描述
重组DNA技术的一般过程
1.目的基因的获取 2.目的基因 和质粒载体 的连接
DNA片段（目的基因）与载体DNA分子相连接，形 成重组DNA
3.将重组DNA分子导入受体细胞 4.选择
选出含有所需要的重组体DNA分子的受体细胞
5.目的基因表达
目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质)
重组质粒DNA的提取、 酶切鉴定
1.0 ml
＋ 200l
悬浮液
细胞悬浮液（STE） 葡萄糖：提供等渗环境，增加溶液的粘度, 防止
DNA受机械作用而降解 Tris·HCl （三羟甲基氨甲烷） :
不含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性 EDTA(乙二胺四乙酸二钠):
螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制DNase保 护DNA；EDTA的存在,有利于溶菌作用。
温放置5min；
(3)加入200l细菌裂解液，颠倒混匀，待溶液变粘稠后，
立即进行下一个步骤； (4)加入150l中和液，上下颠倒混合后置冰上 5min，
12,000转/分，离心 5min；
(5)将上清移至另一管中,加入等体积的TE饱和酚/氯仿
(1:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 2min；
离心 2min
＋等体积TE
饱和酚/氯仿
移上清时要定量，不要混入白色沉淀物或漂浮物
饱和酚/氯仿(1:1)
！！带手套，一旦沾染皮肤请立即用大量清水冲洗！ 酚：使蛋白质变性沉淀 变性效果好，但与水部分互溶。
氯仿：可使蛋白质变性沉淀 变性效果没有酚好，但与水不相混溶。
离心后分层
上层水相含质粒 水相下面是变性蛋白 下层酚/氯仿
冰上 5min后 12,000转/分
离心 5min
移上层水相
于另一管中
7
接提取质粒的操作流程及具体原理
（包括一些试剂的作用原理 ）
移上层水相
于另一管中
分层
＋等体积 氯仿/异戊醇
!!移上清时要定量，宁少勿多!
氯仿/异戊醇(24:1)溶液
氯仿：将残留在水相中的酚带走； 也可以再次使蛋白变性。
异戊醇：降低分子表面张力，减少气泡产生；
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
实验3 质粒的提取和鉴定,DNA酶切-Li revised
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
M pBSK pGFP
质粒DNA提取常见问题
问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1.
2. 3. 4.
1.
请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液 的用量 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素 使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，臵于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
• 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH， 1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液： 5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双
螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链 不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，
变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不
能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力 密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合 物等一起沉淀下来而被除去。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定
系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
质粒DNA的制备 限制性内切酶切割重组质粒
朱文博 中山医学院
基因克隆
• 定义：
经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通 常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
基因工程
• 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为基因工程，又称重组DNA技术。
• 基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
31
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
32
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计
20μl
实验步骤：将10 μl 质粒DNA加入已装有反应缓冲液的 0.2ml EP管，置于已调成37 ℃的PCR仪反应 2h； 余下10 μl DNA保存于-20℃冰箱待做转 化与筛选实验。
变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS
复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
加1.4ml培养物于1.5mlEP管，12000rpm×1min，去上清， 3.3 实 加入冰的200µl 溶液I(保护溶液)，剧烈振荡EP管重悬细菌，室温放置3min 验 加入200µ l 溶液II(高碱)，快速颠倒数次，冰浴3min (不要剧烈振荡！) 步 骤 加入150µl 冰溶液III(高酸)，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min 转移上清500µ l到新EP管，加入等体积500µ l的酚与氯仿/异戊醇的混合物(1:1 混合)，充分颠倒混匀，12000rpm×5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入等体积400µ l氯仿/异戊醇，颠倒混匀， 12000rpm5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800µ l无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000rpm10min
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定共37页
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
研究生实验三 重组质粒 DNA提取、双酶切鉴定
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
Thank you
பைடு நூலகம்
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
重组质粒鉴定
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280= DNA纯净A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告
质粒DNA的提取定量酶切鉴定与PCR实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR 实验日期实验地点合作者指导老师评分 XX 教师签名李某某批改日期 2013-06-03 格式要求:正文请统一用:小四号，宋体，1.5倍行距;数字、英文用Times New Roman;标题用:四号，黑体，加粗。
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一、实验目的1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2、掌握碱裂解法提取质粒的方法3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法4、了解质粒酶切鉴定原理、学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小 5二、实验原理1、PCR:在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，dNTP为原料，通n过变性、退火、延伸等步骤，在体外(缓冲液中)复制DNA，使目的DNA按2方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为:(1)变性:加热反应系统至95?，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
(2)退火:逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温(35~70?,一般低于模板Tm值的5?左右)，与模板DNA互补退火形成部分双链。
(3)延伸:溶液反应温度升至中温72?，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2、质粒DNA的提取:(1)碱裂解法:1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异:2)高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性;3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2)离心层析柱:1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;2)通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;3)低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
质粒提取及双酶切鉴定
(5) 氯仿：异戊醇（24:1）
(6) 无水乙醇、70%乙醇、醋酸钠（pH5.2）
（三）限制性内切酶
1）EcoRI
识别顺序为：5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G ……5’
2）XhoI 识别顺序为：5’…… C|TCGAG ……3’ 3’…… GAGCT|C ……5’
四、实验步骤
一实验目的及原理学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法学习和掌握双酶切鉴定学习和掌握双酶切鉴定二实验原理一质粒提取原理一质粒提取原理质粒plasmid独立于染色体外的能自主复制且稳定遗传的遗传因子是一种环状的双链dna分子
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质粒提取及双酶切鉴定
2011年5月9日
主要内容
4. 加200μl新配制的溶液Ⅱ,立即温和颠倒离心管5次， 使菌体充分裂解, 切勿振荡!将离心管放置于冰上12min。(不要超过2min)。
5. 加150μl用冰预冷的溶液III, 反复温和颠倒5次, 将 管置于冰上3～5min。
6. 4 ℃、12000rpm离心15min,将上清液约400ul转移到另 一离心管中。
(1)溶液Ⅰ:
Tris·HCl(pH8.0)
EDTA(pH8.0)
葡萄糖
(2)溶液Ⅱ(新鲜配制) :
NaOH
0.2mol/L
SDS
1%(W/V)
25mmol/L 10mmol/L 50mmol/L
(3)溶液Ⅲ(100ml):
5mol/L乙酸钾
60ml
冰乙酸
11.5ml(pH4.8)
水
28.5ml
(4) 苯酚
10ХBuffer
2ul
DDW
8ul
重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。
通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。
重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。
酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。
2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。
通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。
3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。
酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。
通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。
这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验第三次分子生物学实验报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、实验目的1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理1、重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)
① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的：
★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。
弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，颠倒混匀，12000rpm×5min 去上清，管平放室温静风干， 20 µ l TE 溶解DNA，其中10 µ l加入酶切反应 管，置于PCR仪37度反应2h，余10 µ l置于-20度冰箱保存
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）
＋
目的基因
接
宿主细胞
＋
重组体
转
已转化的宿主细胞
繁殖
筛
阳性克隆株
表达
基因载体
基因工程中常用的载体(vector)主要包括
质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)
柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致 病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行 筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
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2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
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2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计
20μl
实验步骤：将10 μl 质粒DNA加入已装有反应缓冲液的 0.2ml EP管，置于已调成37 ℃的PCR仪反应 2h； 余下10 μl DNA保存于-20℃冰箱待做转 化与筛选实验。
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） (2)细菌的收集与裂解 • 收集方法：高速离心的方法 • 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 • 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
1.1 定义
能识别DNA的特意序列（酶切位点），并在此位 点或周围催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性 DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
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1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
质粒DNA的制备 限制性内切酶切割重组质粒
朱文博 中山医学院
基因克隆
• 定义：
经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通 常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
基因工程
• 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为基因工程，又称重组DNA技术。
• 基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
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1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
实验内容
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
12
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的基本特征：
(1) 自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；
(2) 可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝
松弛型复制-复制数十个拷贝；
(3) 可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移
到另一个宿主细胞；
变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS
复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
加1.4ml培养物于1.5mlEP管，12000rpm×1min，去上清， 3.3 实 加入冰的200µl 溶液I(保护溶液)，剧烈振荡EP管重悬细菌，室温放置3min 验 加入200µ l 溶液II(高碱)，快速颠倒数次，冰浴3min (不要剧烈振荡！) 步 骤 加入150µl 冰溶液III(高酸)，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min 转移上清500µ l到新EP管，加入等体积500µ l的酚与氯仿/异戊醇的混合物(1:1 混合)，充分颠倒混匀，12000rpm×5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入等体积400µ l氯仿/异戊醇，颠倒混匀， 12000rpm5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800µ l无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000rpm10min
U6启动子 （256bp）
BamHI
5'-G A A T T C-3‘ 3'-C T T A A G-5' Hind III
5'-A A G C T T-3' 3'-T T C G A A-5'Leabharlann 电泳检测2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
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思考题？
• 为什么要用双酶切而不是单酶切割重组质粒DNA？
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高碱
②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对 质粒分子的降解作用。（保护作用）
③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作
(4) 不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质 粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。
14
1.4 理想的克隆载体：
(1) 分子质量小、多拷贝、松弛控制型；
(2) 具有多种常用的限制酶的单切点；
(3) 能插入较大的外源DNA片段；
(4) 具有容易操作的检测表型。
15
15
1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
2.3 核酸分离纯化的总原则：
• (1) 保证核酸一级结构完整 • (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA
3.1 实验原理：
细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；
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1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
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(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
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PUC119 （3.2Kb）
BamHI 双酶切
Hind III 重组质粒（PUC119-U6）