3,5-二硝基水杨酸比色法测还原糖含量
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。
本文将介绍该方法的操作步骤、原理及注意事项。
一、操作步骤1. 样品制备：精确称取适量糖样品，加入足量去离子水稀释至1 mL，摇匀。
2. 试剂制备：(1) Na2CO3试液：称取0.5 g Na2CO3加入50 mL去离子水中，溶解并稀释至1 L。
(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)重量浓度为1 g/L的甲醛溶液：按比例称取适量DNS和甲醛，在去离子水中稀释制成重量浓度为1 g/L的甲醛溶液。
3. 测定步骤：(1) 取3个试管，编号为A、B、C，并进行空白对照。
将A、B、C试管分别加入0.1 mL 样品，每个试管中加入相同量的0.9 mL去离子水。
在空白试管中加入相同量的去离子水代替样品。
(2) 在A试管中加入0.5 mL Na2CO3试液，摇匀。
(3) 将B试管浸于沸水中加热3-5分钟，使其中的还原糖完全还原。
(4) 在A、B两样品试管中加入0.5 mL甲醛溶液，摇匀并置于60℃水浴上加热10分钟。
(6) 加入1.5 mL水后，在空白对照试管和样品试管中均加入0.5 mL DNS溶液，摇匀。
(7) 在95℃水浴加热10分钟，并立即冷却至室温。
(8) 测量吸光度值，通过标准曲线计算样品中还原糖或总糖含量。
二、原理还原糖或总糖与Na2CO3在典型的碱性条件下发生醛基反应，把碳水化合物中的亲电基转化为醛基，再将其还原为对应的醇，生成糖醇和尿素等。
然后，在碱性条件下，醛基与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，发生环化，生成糖醛酸化合物，这些化合物在pH9.0以下表现为桥形分子，具有紫色的吸收峰。
在高温条件下，DNS与糖醛酸化合物相结合，形成柿子色化合物，进一步增加吸收光的强度。
还原糖或总糖的含量可以通过比较样品的吸光度值和标准曲线来测定。
三、注意事项1. 避免试管附着并确保试管内部表面干净。
植物组织中还原糖含量的测定(精)
植物组织中还原糖含量的测定(3，5–二硝基水杨酸法一、实验目的通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作。
二、实验原理3，5–二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色物质（即3–氨基–5–硝基水杨酸，该物质在540nm波长处有最大吸收。
在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质的光吸收值成正比例关系，利用比色法可定量测定样品中的含糖量。
三、实验仪器、试剂和材料1.仪器：25ml刻度试管、离心管或漏斗、三角瓶、容量瓶、刻度吸管、离心机、分光光度计等。
2.试剂：1mg/ml葡萄糖标准液、3，5–二硝基水杨酸3.材料：食用面粉四、实验操作步骤1、葡萄糖标准曲线的制作取7支干燥洁净的25ml刻度试管或大试管，编号，按下表准确加样：0 1 2 3 4 5 6管号葡萄糖标0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2准液/ml蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.83，5–二硝基水杨1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5酸/mlA540 nm将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml，加塞后颠倒混匀。
在540nm波长下，用0号管为参比管调零，分别读取各管的吸光度(A540nm。
以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标绘制标准曲线。
2、样品中还原糖的提取准确称取1.5g食用面粉，放在小锥形瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加25ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，然后将锥形瓶中内容物转入一个50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
充分混合，过滤，滤液即为还原糖待测液。
3、样品含糖量的测定分别取2ml还原糖待测液于两支刻度试管或大试管中，然后各加3，5–二硝基水杨酸1.5ml。
其余操作与制作葡萄糖标准曲线时相同。
测定各管吸光度。
五、实验结果处理以上述还原糖待测液的吸光度平均值，在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。
实验二十还原糖和总糖含量的测定—35-二硝基水杨酸比色定糖法
实验二十还原糖和总糖含量的测定—3、5-二硝基水杨酸比色定糖法目的要求1、掌握3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
2、用3，5-二硝基水杨酸定糖法测定山芋粉中的总糖及还原糖。
3、熟悉721型光电比色计的原理及使用方法。
实验原理3，5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。
试剂和器材1.试剂（1）6mol/L盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液、碘化钾-碘溶液（碘试剂）、酚酞指示剂、85%乙醇。
（2）3，5-二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：甲液——溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。
乙液——称取255g酒石酸钾钠，加到300ml 10%氢氧化钠中，再加入880ml 1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲液与乙液相混合即得到黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7～10d以后使用。
（3）0.2%葡萄糖标准液：准确称取200mg分析纯的葡萄糖（预先在70℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用。
2.器材试管和试管架、碱滴定管（50ml）、铁架台、滴定管夹、移液管（1ml，2ml）、移液管架、容量瓶（100ml）、铜水浴锅、玻璃漏斗、烧杯、铁三脚架、量筒（10ml、100ml）、电热恒温水浴、煤气灯、玻璃棒、白瓷板、721型分光光度计。
操作方法1.葡萄糖标准曲线的制定取9支刻度试管（25ml）或血糖管，分别按下表顺序加入各种试剂：DNS试剂1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5（ml）加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水（ml）21.5 21.5 21.521.521.521.521.521.5 21.5 将上述各管溶液混匀后，在721型分光光度计上进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值,以葡萄糖浓度为横座标，光密度值为纵座标绘制出标准曲线。
实验二 总糖和还原糖的测定(DNS)
实验二总糖和还原糖的测定──3,5－二硝基水杨酸比色法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
三、试剂和器材1、试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取5.0g DNS溶于200ml 2mol/L NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入到酒石酸甲钠的热溶液中（192g就是酸甲钠溶于500ml水中），再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，摇匀溶解后，冷却定容至1000ml，暗处保存备用。
葡萄糖标准溶液：准确称取在105℃的温度下烘干至恒重的葡萄糖0.5g，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至1000ml。
6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。
碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂：0.1g酚酞溶于100ml无水乙醇中。
1％淀粉2、材料淀粉。
3、器材WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，10ml比色管。
四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取6支10ml 比色管并编号，按下表顺序加入各种试剂。
（表1）混匀后置沸水浴上加热5min 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水4.0ml ，摇匀，在540nm 波长下，用0号管调零，分别读取各管的吸光度值A 540。
以葡萄糖含量（mg ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、淀粉水解及还原糖的提取取1％淀粉25ml ，放在100ml 烧杯中，加入6mol/L HCl 10ml ，然后加入蒸馏水15ml ，混匀，于沸水浴中保温30min ，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I 2-KI 溶液检查水解是否完全。
3,5二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究
3,5二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究一、本文概述本文主要研究了3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法在测定溶液中还原糖的应用。
还原糖是一类具有还原性的单糖和低聚糖，如葡萄糖、果糖和麦芽糖等，它们在许多生物化学反应中发挥着重要作用。
因此，准确测定溶液中的还原糖含量对于理解生物过程、食品工业、医药研究等领域具有重要意义。
DNS比色法是一种常用的还原糖测定方法，其原理是利用DNS试剂与还原糖在碱性条件下发生氧化还原反应，生成一种在煮沸条件下呈棕红色的化合物，其颜色深浅与还原糖含量成正比。
通过比色法测定这种化合物的吸光度，就可以间接计算出溶液中还原糖的含量。
本文将详细介绍DNS比色法的实验步骤，包括试剂的配制、实验条件的优化、以及实际样品的分析等。
还将探讨影响测定结果的各种因素，如温度、pH值、反应时间等，以提高测定的准确性和可靠性。
本文还将对DNS比色法与其他常用还原糖测定方法进行比较，以评估其在实际应用中的优缺点。
通过本文的研究，旨在为相关领域的研究人员和技术人员提供一种准确、简便的还原糖测定方法，为深入研究还原糖的生物化学性质和应用提供有力支持。
二、3,5二硝基水杨酸比色法基本原理3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法是一种常用的测定溶液中还原糖含量的方法。
该方法基于还原糖与DNS试剂在碱性条件下发生氧化还原反应的原理。
在反应过程中，还原糖将DNS试剂中的硝基还原为氨基，生成了一种深红色的化合物，这种化合物的颜色深浅与还原糖的含量成正比。
DNS比色法的反应过程可以分为两个阶段。
在碱性环境下，DNS 试剂与还原糖发生缩合反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸。
然后，该中间产物进一步与还原糖反应，生成一种深红色的氨基化合物。
这种颜色变化可以通过比色法进行定量测定，从而确定溶液中还原糖的浓度。
DNS比色法具有操作简便、灵敏度高、重现性好等优点，因此在食品、农业、生物等领域得到了广泛应用。
3,5-二硝基水杨酸比色法测还原糖含量
（四）OD540的测量及标准曲线的制作
1、在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只试管放入500ml装有少量水的烧杯中，进行沸水浴加热5min，再流水冷却。
2、每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。
3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。
酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml 85%的乙醇中，棕色瓶储存。
6mol/LHCl溶液
6mol/LNaOH溶液
面粉样品
0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖1g，用水定容到1000ml。
四.实验仪器
（一）每组配置
试管：10ml*10试管架：1
试管夹：2铁架台：1
移液管：1ml*25ml*2 10ml*1移液管架：1
（二）还原糖液的提取
1、精确称取面粉1.0g于100ml小烧杯中，少量水调成糊状后，再加入50ml蒸馏水搅匀。
2、水浴50℃保温20min后，用水定容到100ml。
3、过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。
（三）总糖的水解与提取
1、称取面粉1.0g，放入100ml小烧杯中。
2、加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.
胶头滴管：2培养皿：1
容量瓶：100ml*3漏斗:1
烧杯:100ml*3500ml*1
（二）公用仪器
分光光度计：3比色皿：3*4
水浴锅：6蒸馏水：瓶*3
滤纸：若干称量纸：若干
废液缸：1L烧杯*3
五．操作步骤
（一）标准梯度糖液配制
分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。
3,5 -二硝基水杨酸比色法测还原糖含量
一、概述还原糖是一类可溶于水的碳水化合物，通常具有甜味。
在食品加工和生产中，还原糖的含量是一个重要的指标。
测定食品中还原糖的含量对于保障产品质量和食品安全具有重要意义。
而3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的方法来测定还原糖的含量。
二、3,5-二硝基水杨酸比色法原理3,5-二硝基水杨酸比色法是利用还原糖与3,5-二硝基水杨酸在酸性溶液中发生还原反应，生成带有黄色的还原糖-3,5-二硝基水杨酸络合物。
通过比色测定络合物的吸光度，可以间接测定还原糖的含量。
这种方法的优点是操作简便、灵敏度高、准确性较好，因此被广泛用于食品、医药等领域的还原糖含量测定。
三、实验步骤1. 样品制备：将待测食品样品制成均匀的糊状。
2. 提取还原糖：将制好的样品用水提取，得到含有还原糖的提取液。
3. 混合试剂：将3,5-二硝基水杨酸试剂与提取液进行混合，使其发生化学反应生成还原糖-3,5-二硝基水杨酸络合物。
4. 比色测定：用比色计测定络合物的吸光度，据此计算出还原糖的含量。
四、实验注意事项1. 实验操作中需注意安全，避免接触到有毒化学品。
2. 实验操作要严格按照步骤进行，避免操作失误。
3. 比色计要保持清洁，以确保测定结果的准确性。
五、实验结果分析通过3,5-二硝基水杨酸比色法测定出的还原糖含量可以作为食品加工和质量控制的重要数据。
实验结果的准确性和稳定性对于保障产品质量和食品安全具有重要意义。
六、实验应用3,5-二硝基水杨酸比色法不仅在食品加工领域有重要应用，还在医药、化工等领域具有广泛的应用。
对该方法的研究和实际应用具有重要价值。
七、结论3,5-二硝基水杨酸比色法是一种简便、灵敏度高的测定还原糖含量的方法，具有较好的准确性和实用性。
在食品加工和生产中，该方法有着重要的应用价值，能够为保障产品质量和食品安全提供重要数据支持。
八、参考文献1. Zhang, Y.; Wu, X.; Chen, Z. A. M. Determination of Reducing Sugars in Low Concentrations by 3,5- dinitrosalicylic Acid Method in Tapered Microfluidic Channels. Anal. Chem. 2017, 89, 9750-9756.2. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 1959, 31, 426-428.以上就是3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的一些基本内容，该方法的简便性和高灵敏度使其成为食品加工和生产中常用的一种检测手段。
3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖
樱桃还原糖测定-3,5－二硝基水杨酸比色法(DNS法)一．原理3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
此法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰较少，是一种很好的糖定量测定方法。
二．试剂1. 3,5－二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）先配置1% 3,5－二硝基水杨酸溶液；A液：溶解6.9 g结晶酚（苯酚）于15.2 mL 10％氢氧化钠中，并用水稀释至69 mL，再向此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠；B液：称取255 g酒石酸甲钠，加到300 mL 10％氢氧化钠中，再加入880 mL 1％3,5－二硝基水杨酸溶液；将A液和B液相混合即得黄色的DNS试剂，保存于棕色试剂瓶中，在室温下放置7~10天后使用，保存期为两个月。
2. 葡萄糖标准曲线配制准确称取100 mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100 mL，保存于冰箱备用。
将1 mg/mL 葡萄糖标准溶液用蒸馏水按照下表进行稀释：三．样品制备和测定将樱桃果肉匀浆后，取约0.08 g的匀浆，加入4 mL蒸馏水混匀后静置进行提取，离心收集上清液备用。
将0.2 mL各浓度的葡萄糖标准溶液或（0.15 ml稀释至合适倍数的样品溶液）与0.15 mL DNS试剂混匀，沸水浴中加热5 min后立即用流动冷水冷却，加入2.15 mL蒸馏水（样品液加水7.2 ml）后测定OD520 nm。
以OD520 nm值为横坐标，以葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
（1）标准曲线：以1为例：取了0.2 ml稀释好的葡萄糖溶液，含糖质量0.02 mg，待测液总体积2.5 ml，葡萄糖液浓度为0.008 mg/mL，对应OD值。
OD值对应的是待测液中葡萄糖的浓度。
（2）待测液总糖含量：Y=kX+b。
Y：反应液样品的浓度。
Y*7.5：7.5ml反应液样品的总糖质量。
3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖 山大
3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖学号姓名日期一．实验目的1.掌握还原糖和总糖测定的基本原理；2.学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用.二．实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9.三．实验试剂与器材1.器材玻璃刻度试管：25mL×9 、烧杯、三角瓶、锥形漏斗、100ml容量瓶、移液管、加热炉、沸水浴、分光光度计3.试剂西瓜汁、1mg/ml葡萄糖标准液、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂四．实验步骤1.样液的准备取2ml西瓜虑汁——定容到100ml——作为样液2.葡萄糖标准曲线的制作以及样液的处理取9支25mL 具刻度试管编号，按下表分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂以及样液，配成不同葡萄糖含量的反应液。
五.实验结果故，管7、8、9中葡萄糖含量为：0.296mg , 0.296mg , 0.302mg 平均值为0.298mg 0.289mg*100/0.5=57.8mg57.8mg/2ml=28.9mg/ml因此西瓜汁滤液中还原糖含量为28.9mg/ml.。
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法实验_百替生物
碳水化合物
实验一 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原
糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶
解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸
水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄
糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨
基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，
（3）显色和比色
取 4 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作 标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
表 2 样品还原糖测定
管号
还原糖待测液 （mL）
总糖待测液 （mL）
蒸馏水 （mL）
DNS
光密度值
（mL） （OD540nm）
提取液总体积 查曲线所得葡萄糖毫克数×
测定时取用体积 还原糖（%）=
样品毫克数
×100
查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数
总糖（%）=
×0.9×100
样品毫克数
六、附 注
1． 离心
时对称位置的离心管必须配平。
2． 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。
3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖含量
3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖含量
3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用于测定糖含量的方法。
该方法基于糖的还原性，利用糖与3,5-二硝基水杨酸反应生成一个特定的有色产物，通过测量这个有色产物的吸光度，可以确定糖的含量。
下面是该方法的步骤：
1. 准备一定浓度的3,5-二硝基水杨酸溶液。
可以将一定量的3,5-二硝基水杨酸粉末溶解在适量的溶剂（如醇）中，制备出一定浓度的3,5-二硝基水杨酸溶液。
2. 准备样品溶液。
将待测糖溶解在适量的溶剂中，制备出合适浓度的糖溶液。
3. 反应。
将一定量的样品溶液与一定量的3,5-二硝基水杨酸溶液混合，在适当的温度下进行反应。
4. 吸收测量。
将反应后的溶液用比色皿装入分光光度计中，设置波长（通常为540 nm），测量吸光度。
5. 构建标准曲线。
根据已知浓度的糖溶液，按照上述步骤测量吸光度，并绘制出吸光度与糖浓度之间的关系图。
可以根据标准曲线来确定未知样品中糖的含量。
需要注意的是，该方法只适用于对还原性糖进行测定，不适用
于非还原性糖的测定。
同时，实验过程中要注意操作规范和安全，避免接触有毒物质。
实验一,3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
二硝基水杨酸法测定还原糖
还原糖含量测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、实验原理还原糖的测定是各种糖类化合物定量测定的基本方法。
在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸（DNS)共热后3,5-二硝基水杨酸(DNS)被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。
在一定范围内，还原糖的浓度与3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)颜色深浅的程度呈正比，利用可见分光光度计，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
二、实验试剂3, 5-二硝基水杨酸试剂( DNS)：将6.3g DNS和262mL 2mol/L的NaOH溶液加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸氢钠，搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。
溶液为黄色，贮于棕色瓶中。
1mg/mL 葡萄糖标准溶液：准确称取80℃烘至恒重的分析纯无水葡萄糖1g，置于烧杯中，加少量水溶解后再加5mL浓盐酸(防止微生物生长)，以蒸馏水定容至1000ml,混匀，4℃冰箱中保存备用。
碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
酚酞指示剂：称取1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。
6mol/L HCI溶液：取250mL浓HCI,用蒸馏水稀释到500mL。
6mol/L NaOH溶液：称取240g NaOH, 溶于1000mL蒸馏水中。
三、实验方法1．制作葡萄糖标准曲线取6支试管编号，按照表3-1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂。
将各管混匀，用0号管调零点，在540nm波长处测1-5管吸光度。
以葡萄糖毫克数为横坐标，A540为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品中还原糖的测定（食用面粉为例）准确称取2.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50-60mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。
植物组织中还原糖含量的测定
植物组织中还原糖含量的测定应用化学1101 A20110001程志永植物组织中还原糖含量的测定程志永（东北农业大学理学院应用化学系，哈尔滨，150000）摘要：本实验以葡萄糖为标准，以3,5- 二硝基水杨酸(DNS)作显色剂，用分光光度法测定黄瓜中还原糖的含量。
在碱性条件下，3，5–二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的3–氨基–5–硝基水杨酸，该物质在540nm波长处有最大吸收。
在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质的光吸收值成正比例关系，利用比色法可定量测定样品中的含糖量。
关键词：还原糖；分光光度法；3,5-二硝基水杨酸中图分类号：Q5-33文献标志码：A引言DNS 比色法的原理是：3,5-二硝基水杨酸在碱性溶液中被还原糖还原成氨基化合物，在沸水浴中显色时间5min，波长在540nm下有最大吸收峰。
试验过程中的诸多因素如吸收光谱、显色剂用量、显色时间等均对测定结果的准确性有直接影响。
因此，我们对用3,5-二硝基水杨酸比色法测定马铃薯块茎还原糖含量的反应条件进行了一系列的试验，试图摸索最佳的试验条件以保证试验的精确度，以期获得可靠的数据为黄瓜品质育种的实践提供参考。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试药剂3,5-二硝基水杨酸；蒸馏水；葡萄糖溶液。
1.1.2 供试植物材料黄瓜0.96g1.2 实验方法1.2.1 葡萄糖标准曲线的制作称取0.0502g葡萄糖，定容至500ml；吸取葡萄糖标准液0、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，分别置于10mL试管中，编号1、2、3、4、5、6，各加蒸馏水使体积为1.0mL，再加苯酚试液0.51mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸2.5 mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热约15min，取出后冷却至室温。
以一号试管为对照组。
用721分光光度计，1cm比色皿，在490nm 处测定吸光度，绘制葡萄糖浓度-吸光度工作曲线。
1.2.2 样品中还原糖含量的测定1.2.2.1还原糖的提取准确称取样品0.5g，用少量蒸馏水研磨成匀浆，然后加入蒸馏水定容至50mL，摇匀，置于50℃恒温水浴中保温10min，使还原糖浸出，移入离心管，4000r/min下离心10min，取上清液。
实验一-3--5--二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖
实验一3, 5 -二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖1、实验目的：掌握还原糖和总糖测定的基本原理掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
2、实验原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
3、实验步骤：（一）葡萄糖标准曲线制作1. 取6个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水2. 向各试管中分别加入DNS试剂1 ml，充分混合，放入沸水浴中加热煮沸2 min 进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯中迅速冷却。
3.向各管中分别加入8 ml蒸馏水，充分混合。
4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测定各管的OD 值。
5.以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。
如果该直线不通过零点，必须重做。
（二）还原糖的制备1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的三角瓶中，然后加入20~30ml蒸馏水，搅拌均匀。
2. 把三角瓶放于一个50℃水浴中保温30 min，不时搅拌。
3. 拿出三角瓶，将三角瓶内含物转入50ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混合，滤出液即为还原糖提取液。
(三) 样品总糖的水解和提取1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 盐酸，混匀。
2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。
3.取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。
如已水解完全，则不呈现蓝色。
4.拿出三角瓶，冷却，过滤，滤出液即为总糖提取液。
5.加入3-5滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微红色。
将中和后的溶液转入100 ml的容量瓶中定容。
（四）样品中含糖量的测定1. 取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。
面粉中还原糖的测定--3,5-二硝基水杨酸比色法
--3,5-二硝基水杨酸比色法
一、原理 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一
定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶 解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的 双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定。再求出样品中 还原糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
将 6.3g DNS 和 262mL 2M NaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠
的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容 至 1000mL，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤
1．制作葡萄糖标准曲线
取 6 支 20ml 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖 标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应 液。
面粉，中性滤纸。 2．主要仪器 （1）比色管 （2）具塞玻璃刻度：20mL×9 （3）烧杯 （4）漏斗 （5）容量瓶：100mL,1000mL （6）刻度吸管：1mL；2mL；10mL （7）恒温水浴锅 （8）电子天平 （9）紫外可见分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL 葡萄糖标准液
准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸 馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容 100mL，混匀，4℃冰箱中 保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将浸出液（含沉淀）过滤到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作
为还原糖待测液。
（2）显色和比色 取 3 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，
3,5-二硝基水杨酸法测定蔓菁中还原糖和总糖含量
3,5-二硝基水杨酸法测定蔓菁中还原糖和总糖含量
蔓菁是一种富含营养的农作物，其含有丰富的还原糖和总糖。
在食品加工和贮藏时，
了解蔓菁中还原糖和总糖的含量对其质量和安全具有重要意义。
因此，本文采用3,5-二硝基水杨酸法测定蔓菁中还原糖和总糖含量。
实验方法：
1.材料准备
蔓菁样品、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、硫酸、乙醇、蒸馏水、卡宾试剂、高锰酸钾、磷酸和硫酸铜等。
2.还原糖的含量测定
（1）还原糖的提取
将1克蔓菁样品粉末加入25ml的蒸馏水中，用搅拌器搅拌5分钟，过滤液收集于滤器上，去渣留液。
取上述滤液5ml，加入5ml的3,5-二硝基水杨酸试剂，室温下反应10分钟，加入10ml 的氢氧化钠溶液，放置5分钟。
将溶液体积加至50ml之后，用紫外分光光度计测定吸光值，计算还原糖含量。
（2）总糖的定量
实验结果：
采用硫酸铜法测定，蔓菁样品中总糖含量为12.25g/100g（干重）。
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1、标准曲线的制作建议用EXCEl制作，也可以只用坐标纸，用最小二乘法得出公式，需附图在实验报告上。
2、本实验中用水浴锅进行操作，沸水浴操作时，只需将温度控制在90~93℃即可，温度过高（超过95℃）会使还原糖煮糊。
酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml 85%的乙醇中，棕色瓶储存。
6mol/LHCl溶液
6mol/LNaOH溶液
面粉样品
0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖1g，用水定容到1000ml。
四.实验仪器
（一）每组配置
试管：10ml*10试管架：1
试管夹：2铁架台：1
移液管：1ml*25ml*2 10ml*1移液管架：1
3，5-二硝基水杨酸比色法测量还原糖含量
一．实验目的
1、掌握用制作标准曲线的方法来测量还原糖的含量.
2、学会使用721精密型分光光度计。
3、熟练容量瓶、移液管等简单仪器的使用方法。
二．原理
1、还原糖是指含有醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，多糖中有乳糖和麦芽糖等是还原糖，而淀粉和蔗糖是非还原糖。DNS即3，5-二硝基水杨酸中含有的硝基使其有较强的氧化性，与醛基在加热的条件下发生氧化还原反应，生成红色物质3-氨基-5硝基水杨酸。反应方程式如下：
3、用胶头滴管滴2~3滴碘化钾—碘溶液于培养皿中（可以稍微稀释），用细玻璃棒蘸少量样品与之进行反应，若无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全，否则继续沸水浴加热并每隔5min以相同的方法再次测定，直至完全水解。
4、取出完全水解的样品，冷却后滴加2~3滴酚酞，用6mol/LNaOH滴定至中性。
5、用水定容到100ml，过滤，取5ml滤液，再次定容到100ml。
2、不同浓度的还原糖液与DNS反应时，生成的3-氨基-5硝基水杨酸的浓度不同，导致反应后液体颜色深浅不同。在分光光度计下测量标准梯度浓度的葡萄糖溶液与DNS反应后液体的OD540（波长为540nm条件下样液的光密度值），做出OD540——还原糖含量标准曲线，对于未知样品的测量，只需将OD540带入图像，找到相应的还原糖含量值即可。
胶头滴管：2培养皿：1
容量瓶：100ml*3漏斗:1
烧杯:100ml*3500ml*1
（二）公用仪器
分光光度计：3比色皿：3*4
水浴锅：6蒸馏水：瓶*3
滤纸：若干称量纸：若干
废液缸：1L烧杯*3
五．操作步骤
（一）标准梯度糖液配制
分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。
（二）还原糖液的提取
1、精确称取面粉1.0g于100ml小烧杯中，少量水调成糊状后，再加入50ml蒸馏水搅匀。
2、水浴50℃保温20min后，用水定容到100ml。
3、过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。
（三）总糖的水解与提取
1、称取面粉1.0g，放入100ml小烧杯中。
2、加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.
6、取5中第二次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。
（四）OD540的测量及标准曲线的制作
1、在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只试管放入每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。
3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖的试管即1号试管内的液体作为参比液。
三．试剂（配制方法）
提前配制试剂
DNS（3,5-二硝基水杨酸试剂）：6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/LNaOH加到热酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶液溶于500蒸馏水中），再加5g重结晶酚和5g亚硫酸氢钠于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000ml，储存于棕色瓶中。
碘化钾—碘试剂：称取5g碘10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
4、取1~6号试管中的数据，做出OD540~还原糖含量曲线，纵坐标为OD540，横坐标为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，单位mg。
5、在曲线上读出7~10号试管的含量值。
（五）计算含量
1、取7，8号试管含量的平均值作为还原糖含量值，取9，10号试管含量的平均值作为总糖的含量值。
2、
六．实验注意