第四章_酶活力的测定
酶活性的测定原理
酶活性的测定原理
酶活性是指单位时间内酶所催化的底物转化的速率。
测定酶活性的原理主要基于酶和底物之间的反应，通常采用比色法、发光法、电化学法等不同技术来测量产物的生成量。
一种常用的测定酶活性的方法是比色法，该方法主要通过测量底物转化后所产生的色素的强度或吸收率来反映酶活性的大小。
具体操作步骤如下：
1. 首先，准备好所需的实验试剂和设备，包括底物、酶溶液、缓冲液、比色剂等。
2. 将酶溶液加入适当的量的缓冲液中，以调节pH值和酶的浓度。
此步骤有助于提供适宜的反应环境，以发挥酶的最佳催化效果。
3. 在试管中加入适量的底物溶液。
4. 立即加入酶溶液，并立即开始计时。
为了确保测量的准确性和可比性，要确保每个实验条件下反应时间一致。
5. 在一定时间内（通常为几分钟或数十分钟），停止反应。
这可以通过加入酶活性停止剂、改变反应条件或其他合适的方法来实现。
6. 加入比色剂，使产物产生明显的颜色。
比色剂的选择要根据具体试剂和底物的特性来进行，以保证在所使用的检测设备
（如分光光度计）的波长范围内有明显的差异。
7. 使用合适的仪器（如分光光度计）测量产生的色素的吸光度或强度。
根据吸光度或强度的变化，可以通过对比标准曲线或对照组的结果，计算出酶活性的数据。
需要注意的是，在测定酶活性时，实验条件的控制非常重要。
包括温度、pH值、底物浓度和酶浓度等因素的选择和控制，都会对测定结果产生影响。
因此，在进行酶活性测定时，应该对这些因素进行合理的控制和调节，以提高实验结果的准确性和可比性。
酶的活性测定实验
酶的活性测定实验酶是一类具有生物催化作用的蛋白质，广泛存在于生物体内。
通过测定酶的活性，可以更好地了解酶在生物体内的功能和作用。
本文将介绍一种常用的酶活性测定实验方法。
一、实验目的本实验旨在通过测定酶的活性，了解酶的催化作用和酶动力学特性。
二、实验原理本实验采用间接法测定酶的活性。
在反应过程中，酶与底物反应生成产物，产物的形成量与酶的活性呈正相关关系。
三、实验材料和仪器1. 酶溶液（待测）：使用酶提取物或商用酶溶液。
2. 底物溶液：适当浓度的底物溶液，可以根据实验需要选择不同的底物。
3. 反应液：含有酶溶液、底物溶液和缓冲溶液的混合液。
4. 停反液：酸性或碱性溶液，用于停止酶的活性。
5. 试管或微量离心管：用于容纳反应液和停反液。
6. 恒温水浴：用于控制反应的温度。
7. 分光光度计：用于测定反应液的吸光度变化。
四、实验步骤1. 准备反应液：根据实验需要，将适量的酶溶液、底物溶液和缓冲液按一定比例混合，制备反应液。
2. 设定反应温度：使用恒温水浴，将反应液恒温至所需的实验温度。
3. 开始实验：将预先准备好的反应液加入试管或微量离心管中，立即放入预热恒温水浴中开始反应。
4. 反应时间控制：根据酶活性的快慢，控制反应时间，一般可选择1-10分钟不等。
5. 停反应：反应结束后，立即加入适量的停反液，停止酶的活性。
6. 吸光度测定：将停止反应后的混合液取出一部分，使用分光光度计测定其在特定波长下的吸光度。
五、数据记录与分析1. 记录吸光度测定结果：将吸光度测定的结果记录下来，分别对应不同的测定时间点。
2. 绘制反应曲线：将吸光度与测定时间点进行绘制，得到反应曲线。
3. 计算反应速率：根据反应曲线的斜率，计算反应速率。
4. 测定酶活性：根据反应速率的计算结果，测定酶的活性，一般以单位时间内产生单位底物的量表示。
六、实验注意事项1. 实验过程中要严格控制温度，避免温度的变化对实验结果的影响。
2. 底物浓度和反应时间要根据实验需要进行适当选择，过高或过低的浓度和时间都会对实验结果产生影响。
酶的活性测定实验报告
一、实验目的1. 了解酶活性测定的原理和方法。
2. 掌握酶活性测定的操作步骤。
3. 学会分析实验结果，了解酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的进行。
酶活性是指酶催化特定反应的能力，通常以单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示。
本实验采用比色法测定酶活性，通过测定酶催化反应产物的生成量来间接反映酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、电子天平、移液器、试管等。
2. 试剂：淀粉酶、淀粉溶液、碘液、NaOH溶液、HCl溶液等。
3. 材料：新鲜土豆、苹果、黄瓜等。
四、实验步骤1. 淀粉酶的提取- 称取新鲜土豆或苹果，切碎后加入适量的蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆过滤，取滤液备用。
2. 淀粉溶液的制备- 称取一定量的可溶性淀粉，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
- 将淀粉溶液煮沸，使其糊化，冷却后备用。
3. 酶活性测定- 取适量淀粉溶液，加入一定量的酶液，混合均匀。
- 将混合液放入恒温水浴中，保持一定温度。
- 定时取样，用碘液滴定，计算淀粉的剩余量。
- 根据淀粉的剩余量，计算酶活性。
4. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 将淀粉溶液和酶液在不同温度、pH值下进行混合，观察酶活性变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定结果- 根据实验结果，计算酶活性单位。
2. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 在不同温度、pH值下，酶活性变化如下：- 温度：在适宜的温度范围内，酶活性随着温度的升高而增加，超过适宜温度后，酶活性逐渐降低。
- pH值：在适宜的pH值范围内，酶活性随着pH值的升高而增加，超过适宜pH值后，酶活性逐渐降低。
六、实验结论1. 酶活性是指酶催化特定反应的能力，可以通过比色法等方法进行测定。
2. 酶活性受温度、pH值等因素的影响，适宜的温度和pH值可以提高酶活性。
3. 本实验成功测定了淀粉酶的活性，并探讨了温度、pH值等因素对酶活性的影响。
酶活力测定方法
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。返回练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
说明测定酶活力时的一般步骤
说明测定酶活力时的一般步骤
酶活力的测定呀，就像是一场小小的科学探险呢。
咱先得准备好各种东西。
要有合适的底物，这底物就像是酶要去攻克的小城堡一样。
还有缓冲溶液，这就像给整个反应创造一个舒适的小环境，让酶能舒舒服服地工作。
当然啦，酶的样品肯定不能少呀。
然后呢，就开始把这些东西混合在一起。
把酶和底物放在一起的时候，就像是一场奇妙的相遇。
这时候反应就开始啦，酶就像一个超级小工匠，开始对底物进行加工改造。
在反应进行的时候呀，我们得注意时间哦。
就像烤小饼干，烤太久就糊了，反应时间太长或者太短都不行。
要选择一个恰到好处的时间点，这个时间得根据酶的特性来定呢。
接着呢，我们要想办法检测反应的结果。
这就有很多有趣的方法啦。
比如说，如果反应产生了有颜色的东西，那我们就可以用比色法，就像看哪个小溶液颜色更漂亮一样。
或者如果有气体产生，我们还可以测量气体的量呢。
等检测完结果之后呀，我们就能根据这些数据来计算酶的活力啦。
这个计算过程就像是在解一个小谜题，根据我们之前知道的一些规则和数据，算出酶到底有多能干。
不过在整个过程中呀，可一定要小心呢。
就像照顾小宠物一样，每个小细节都要注意到。
比如说温度呀，温度不合适的话，酶可能就会偷懒不干活啦。
还有pH值，要是这个没调好，酶可能也会闹小脾气呢。
测定酶活力虽然听起来有点复杂，但就像做一个超级有趣的小实验，每一步都充满了惊喜和发现哦。
第四章 酶法分析
优点：
不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景
食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活力测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质：综合性实验计划学时：6所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：09生物工程2班******学号：************实验课指导老师：沈玉栋摘要测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。
本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。
其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。
关键词：酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法1 前言酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。
随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。
目前已有几十种酶成功地用于食品工业。
例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。
应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。
酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。
作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。
它能把淀粉从非还原性未端水介a-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。
酶活力测定的原理和方法
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
D 量热法
• 由于在反应过程中有反应热的变化，用 非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度。
该法灵敏，无干扰，且很通用，近年来
逐渐引起了人们的重视。
E 旋光法
• 在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有 所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶 反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物 来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比 旋络合物，故可用旋光计跟踪 LDH 催化的乳酸 和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由 于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采 用
《酶活力的测定》课件
数据记录与整理
实验数据记录
在实验过程中，应准确、及时地记录实验数据，包括实验条件、实验步骤、实 验结果等。
数据整理
将实验数据整理成表格或图表，便于分析和比较。数据整理时应确保数据的准 确性和完整性。
数据分析与处理
数据分析
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、误差等指 标的计算。
数据处理
对异常值或离群数据进行处理，如剔除、替换或修正，以确 保数据分析的准确性。
未来，酶活力测定技术的发展将更加注重高灵 敏度、高特异性和自动化方向，为生物工程领 域的研究提供更加精准和高效的工具。
感谢您的观看
THANKS
问题
实验操作复杂，耗时较长。
改进建议
优化实验流程，简化操作步骤，提高实验 效率。
酶活力测定在生物工程领域的应用前景
酶活力测定是生物工程领域中重要的研究手段 ，可用于研究酶促反应动力学、酶的抑制剂和 激活剂等方面的研究。
随着生物工程技术的不断发展，酶活力测定的 应用范围将不断扩大，如应用于生物制药、生 物能源和生物环保等领域。
通过实验，我们掌握了酶活力测定的基本原理和方法，学会了如何设置实验条件和 操作实验。
实验过程中，我们观察到了酶促反应的动力学特征，如米氏方程的适用性和酶促反 应的速率常数。
实验中存在的问题与改进建议
问题
改进建议
实验过程中存在误差，如温度控制不精确 、底物浓度不均匀等。
采用更精确的仪器和设备，如恒温控制器 和磁力搅拌器，以提高实验的准确性和可 重复性。
米氏方程是描述酶促反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为V=Vmax[S]/（Km+[S]），其中V代表反应速率，Vmax代表 最大反应速率，[S]代表底物浓度，Km代表米氏常数。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定可是个超级重要的事儿呢！就好像我们要了解一个运动员有多厉害，得看他在赛场上的表现一样。
那怎么去测定酶活力呢？嘿，方法可多啦！
一种常见的方法就是比色法。
这就好比我们通过观察颜色的变化来判断事情的进展。
通过特定的化学反应，让酶和底物作用，然后产生一些有颜色变化的物质，我们根据颜色的深浅来衡量酶活力的高低。
你说神奇不神奇？
还有一种是荧光法，哇哦，这就像是在黑暗中找到那闪闪发光的宝贝。
利用酶反应会引起荧光强度的变化，从而准确地知道酶活力的大小。
再说说同位素测定法，这可有点高科技的味道了呢！就如同有个超级侦探在追踪着微小的线索。
通过标记同位素，然后观察它们的变化，来确定酶活力。
另外，电化学法也不能小瞧呀！它就如同一个敏锐的传感器，能精确地捕捉到微小的电信号变化，进而反映出酶活力的情况。
这些方法各有各的奇妙之处，各有各的用处。
我们可以根据不同的酶、不同的实验条件去选择最合适的方法。
难道不是吗？
酶活力测定在生物、医学、化学等领域都有着至关重要的地位。
它就像是打开一扇门的钥匙，让我们能深入了解那些神奇的生物化学反应。
没有准确的酶活力测定，我们怎么能更好地研究疾病的发生机制？怎么能研发出更有效的药物？怎么能推动科学的进步呢？
所以啊，我们一定要重视酶活力测定，不断探索和改进测定的方法。
让我们能像超级英雄一样，揭开酶的神秘面纱，为人类的健康和科学的发展贡献自己的力量！这是多么有意义的事情啊！。
《生物化学》第四节 酶的活力测定及分离提取
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反竞争反应模式
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反竞争性抑制的双倒数方程
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反竞争性抑制的双倒数图形特征
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反竞争性抑制的特点：
⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的 分子结构类似；
⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制
第四节 酶的活力测定及分离提取
一、酶活力的测定 （一）活力（性）的表示方法 （二）测定 二、酶的分离提取
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一、酶活力的测定
（一）活力（性）的表示方法 １、活力—— v
测定酶活力就是测定酶促反应速度。 v ：单位时间内产物的生成量。
单位时间内底物的消耗量。
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2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位 时间内催化一定量的底物起反应所需的酶 量。 1 个酶活力单位（U） ，是指在特定条件下， 在1 分钟内能转化1 微摩尔（μmol）底物的 酶量或是转化底物中1μmol 的有关基团的酶 量。
（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低， 但温度升高后，酶活性又可恢复。
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六、激活剂对υ的影响
能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激 活剂。 1、无机离子 阴离子 Cl－、Br－ ； 阳离子 H+
金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。 2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基
复合物结合，使酶的催化活性降低，称为 非竞争性抑制。
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反应模式
酶法解析
测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ？
——速度方程
测定酶活力的基本要求：
1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度 的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；
2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大 能力）；
所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下 几方面做工作：
E1
A
B
E2 C
被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B 是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的 脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过 NADH的特征变化而测知。
HK
被测反应： G + ATP
G-6-P + ADP
偶联指示反
G6PDH
应： G-6-P + NADP
NADPH + 6-PGCOOH
以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性；
如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；
葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等；
酶法分析（ENZYME ANALYSIS）
酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试 剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、 活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品 有关的样品中酶以外其他物质的含量。
第四章 酶分析法
酶分析法：
酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）
前者的目的在于检知样品中某种酶的 含量或活性，后者则主要用于测定与生 物学有关的样品中酶以外其它物质的含 量。两者检测对象不同，但原理基本一 致：酶的专一性、高效性，通过酶反应 速度测定物质的变化进行定量分析。
酶分析 （Enzyme Assay）
酶活性的测定(1)
酶活性的测定1 实验背景（1）酶活性的定义酶活性（enzyme activity）也称酶活力，指酶催化指定化学反应的能力酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的化学反应的速率来表示，反应速率愈快，就表明酶活力愈高酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，实际酶活性测定中一般以测定产物的增加量为准012345678910111213141551015202530时间/min产物的量酶活性＝反应初速率＝产物量的变化/时间/ m m o l /LpNPP （磷酸对硝基苯酚）pNP （对硝基苯酚）＋Pi碱性磷酸酶（2）酶活性的测定方法方法原理优点缺点分光光度法底物、产物或指示剂在紫外或可见光部分吸光度不同操作简便，节省时间和样品，可用于动力学监测灵敏度相对较低荧光法底物、产物的荧光性质有差别灵敏度高易受其它物质（特别是蛋白质）干扰同位素测定法底物用放射性同位素标记灵敏度高操作复杂，代价昂贵电化学方法用pH计跟踪H+浓度的变化操作比较简便仅适用于有H+生成或消耗的反应碱性磷酸酶测活原理pNPP （磷酸对硝基苯酚）pNP （对硝基苯酚）＋PiA 410= ε（λ）C LpNP 的摩尔消光系数ε（λ）为17500 mol -1·L·cm -1117500A C 410⨯=碱性磷酸酶肌酸激酶测活原理肌酸＋MgATP2-MgADP-+ 磷酸肌酸+ H+用百里酚蓝作为pH指示剂，测定597 nm吸光度的变化，用于计算酶活性[H+]∆A597= 1.3 ∆[H+]将酶加入底物溶液中，快速混合，开始反应 反应一段时间后，加入反应终止液，终止反应使用分光光度计测定产物的浓度，计算酶活性①终止法测定碱性磷酸酶的活性123456789101112131415051015202530时间/min产物的量/ m m o l /L●计算酶样品的活力单位数（U，activity unit）酶活力单位是酶活力大小的一种衡量单位按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25℃等）下，1分钟内能催化1μmol底物转化为产物所需的酶量1 IU=1 μmol/min碱性磷酸酶活力国际单位规定：以pNPP 为底物，在pH 为8.5，30o C 下每分钟产生1μmol pNP 所需要的酶量为一个活力单位1011750010004.0A 6410⨯⨯⨯⨯=位数碱性磷酸酶活力国际单管号测活液AKP 30o C反应10min终止液A 410360 μL40 μL3.6 mLn V ⨯⨯04.0)ml (V ：碱性磷酸酶样品的总体积；n ：酶样品的稀释倍数碱性磷酸酶活力国际单位数●计算酶样品的比活力酶的比活力指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数比活力= 总活力U/总蛋白mg比活力是酶纯化程度的指标04.0c 101 1750010004.0A6 410⨯⨯⨯⨯⨯=碱性磷酸酶比活力C：碱性磷酸酶样品的浓度（mg/mL）碱性磷酸酶比活力②连续法测定碱性磷酸酶的活性将适量酶加入底物溶液中，快速混合将酶与底物的混合液迅速转移入比色杯中，放入分光光度计 利用分光光度计连续测定吸光度的变化利用吸光度变化的动力学曲线与 A值计算酶活力连续法测定碱性磷酸酶的活性11750010002.0A 位数碱性磷酸酶活力国际单6410⨯⨯⨯∆=碱性磷酸酶活力国际单位数测活液AKP 30o C 连续反应∆A 4102 mL 22 μL2 实验试剂（1）底物溶液（测活液）pH 8.5100 mL 50 mmol/L Tris-HCl0.2 mg/mL BSA10 mmol/L pNPP2 mmol/L MgAc2（2）酶稀释液pH 8.5100 mL50 mmol/L Tris-HCl0.2 mg/mL BSA2 mmol/L MgAc22 实验试剂（3）测活终止液0.5 mol/L Na3PO410 mmol/L EDTA3 实验操作1）准备4个玻璃试管，放在试管架上，用微量移液器将0.2mL酶稀释液加入1号试管中，然后将0.2mL酶溶液加入1号试管，用旋涡混合器混合；接下来，将0.2mL 酶稀释液加入2号试管，从1号试管取出0.2mL液体样品，加入2号试管，用旋涡混合器混合；将0.2mL酶稀释液加入3号试管，从2号试管取出0.2mL液体样品，加入3号试管，用旋涡混合器混合；将0.2mL酶稀释液加入4号试管，从3号试管取出0.2 mL液体样品，加入4号试管，用旋涡混合器混合。
第四章_酶活力的测定
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一、酶活力
酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、 最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等， 只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。 测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大， 测定底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速率， 这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能 比较可靠地反映酶的含量。
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二、酶活力的测定
在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时, 用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖 氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。
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二、酶活力的测定
5.其他方法 除上述方法外，还有一些测定酶活力的方 法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法 等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差, 只是应用于个别酶活力的测定。
②反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、 pH等条件。温度可选在室温(25℃)、体温(37℃)、酶促 反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进 行。pH应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定 pH的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程 中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其 他条件，应适量添加。
酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。
酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。
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一、酶活力
2.酶活力单位
酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示, 即酶单位(activity unit，U)。 酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。
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二、酶活力的测定
5.其他方法
除上述方法外，还有一些测定酶活力的方 法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法 等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差, 只是应用于个别酶活力的测定。
第四章 酶活力的测定
第四章 酶活力的测定
第一节 酶的结构与性质(略) 第二节 酶活力测定方法
第二节 酶活力测定方法
一、酶活力 二、酶活力的测定
一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。
二、酶活力的测定
4.电化学方法
电化学方法包括：pH测定法和离子选择电极法等。 pH测定法最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的 pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化 来测定酶的反应速率。也可以用恒定pH测定法，在酶 反应过程中，所引起的H+的变化用不断加入碱或酸来 保持其pH恒定，用加入的碱或酸的速率来表示反应速 率。用此法可以测定许多酯酶的活力。
教材及参考书（第四章）
酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。
酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。
一、酶活力
2.酶活力单位
酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示, 即酶单位(activity unit，U)。 酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。
一、酶活力
3.酶的比活力
酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示： 酶比活力=[ 酶活力单位数(U) / 蛋白质量(mg) ]
有时也采用每克(g)酶制剂或每毫升(mL)酶制剂含 有多少个活力单位来表示。 比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化 能力。比活力是酶学研究及生产中经常使用的指标。
二、酶活力的测定
2.酶活力的测定方法
测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测 法、化学检测法等生化检测技术。 一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况 选用。
二、酶活力的测定
1.分光光度法
酶
活
2.荧光法
力
的
3.同位素测定法
测
定
4.电化学方法
方
法
5.其他方法
二、酶活力的测定
1.分光光度法
确定酶促反应条件： pH、温度等
准确计时并终止反应
运用各种检测技术， 快速、简便、准确的 测定变化量
二、酶活力的测定
①底物：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成 一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达 到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可 预先配制后置冰箱保存备用。
②反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、 pH等条件。温度可选在室温(25℃)、体温(37℃)、酶促 反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进 行。pH应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定 pH的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程 中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其 他条件，应适量添加。
例如，1IU＝lμmol/min；1Kat = 1mol/s
一、酶活力
酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、 最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等， 只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。 测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大， 测定底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速率， 这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能 比较可靠地反映酶的含量。
二、酶活力的测定
3.同位素测定法
用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到产 物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出 酶的活力单位。 已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。 通常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和 131I等。
二、酶活力的测定
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。 缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。
二、酶活力的测定
③反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶 液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时 间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、 反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用： 加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。
④底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的 反应液，运用各种生化检测技术，测定产物增加量或底 物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量 采用快速、简便、准确的方法测出结果。
二、酶活力的测定
由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些 原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸 收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成 为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这 种方法称为酶偶联测定法。
二、酶活力的测定
2.荧光法
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。 该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。
二、酶活力的测定
要求酶活力的测定方法：快速、简便、准确。
1.酶活力的测定步骤 酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定的 条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后 再测定反应液中底物或产物变化的量。
选择底物 配制底物溶液
酶活力 的测定步骤
二、酶活力的测定
① 底物 ② 反应条件
③ 反应时间
④ 底物或产物 变化量
分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光 部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反 应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间 和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连 续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测 定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都 可以用此法测定。