土壤中纤维素分解菌的分离

例1、(20分)某化工厂的污水池 中，含有一种有害的、难于降 解的有机化合物A。研究人员 用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成 功地筛选到能高效降解化合物 A的细菌(目的菌)。实验的主 要步骤如图所示。请分析回答 问题：（北京卷）
(5)若研究“目的菌”的生长规律，将单个菌 落进行液体培养，可采用的方法进行计数， 细菌数目的对数 为纵 以时间为横坐标，以 坐标，绘制生长曲线。
专题二
课题3
微生物的培养与应用
分解纤维素的微生物 的分离
一、课题目标
简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分 离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的 应用价值。
（1）纤维素酶分解纤维素生化原理 （2）区别选择培养与鉴别培养概念 （3）比较纤维素粉培养法与刚果红染色法原理
二、课题重点与难点
从土壤中分离分解纤维素的微生物。
制备菌悬液： 按照本专题课题1的稀释操作方法，将 选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大 倍数至106。 涂布平板： 将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液 涂布均匀，在30 ℃倒臵培养，至菌落长出。 每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设臵对 照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资 料三］。
例1、(20分)某化工厂的污水池 中，含有一种有害的、难于降 解的有机化合物A。研究人员 用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成 功地筛选到能高效降解化合物 A的细菌(目的菌)。实验的主 要步骤如图所示。请分析回答 问题：（北京卷）
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培 化合物A ，实验需要振荡培养，由此 养基中的 异养需氧 推测“目的菌”的代谢类型是 。
答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对聚集，实际上是人工设臵纤维素分解菌生 存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10 cm左 右腐殖土壤中。
4.想一想，两种刚果红染色法各有哪些优点 与不足？你打算选用哪一种方法？
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果 红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出 的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题， 缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物 质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。 但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊， 因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素 酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些 微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程 中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌 不易区分。
梯度稀释
将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上
挑选单菌落
发酵培养
本课题知识小结:

根据用途分 选择培养基——在培养基中加入某种化学
物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所 需要的微生物的生长 鉴别培养基——在培养基中加入某种指示 剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 。 例如：伊红和美蓝,和大肠杆菌的代谢产物结 合,使菌落呈黑色（老教材说法：深紫色,带 有金属光泽）, 鉴别大肠杆菌
例1、(20分)某化工厂的污水 池中，含有一种有害的、难 于降解的有机化合物A。研 究人员用化合物A、磷酸盐、 镁盐以及微量元素配制的培 养基，成功地筛选到能高效 降解化合物A的细菌(目的菌)。 实验的主要步骤如图所示。 请分析回答问题：（北京卷）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
(4)转为固体培养时，常采用 划线 方 法接种，获得单菌落后继续筛选。
例1、(20分)某化工厂的污水池 中，含有一种有害的、难于降 解的有机化合物A。研究人员 用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成 功地筛选到能高效降解化合物 A的细菌(目的菌)。实验的主 要步骤如图所示。请分析回答 问题：（北京卷）
(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化 合物A含量 减少 的培养液，接入新 的培养液中连续培养，使“目的菌”的 数量 增加 。
五、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格以及选择 培养基是否筛选出菌落： 对照的培养基在培养过程中没有菌落生 长则说明培养基制作合格。如果观察到产生 透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维 素的微生物。 （二）分离的结果是否一致： 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌 和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是 细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也 可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
三、基础知识
（一） 纤维素与纤维素酶 1.纤维素在生物圈的分布；
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质.植物的 根茎叶等器官都含有大量的维生素.地球上的植物每年 产生的纤维素超过70亿吨. 人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维 素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能 量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量 的可以分解纤维素的微生物。
3.刚果红染色法分离 纤维素分解菌这一步所需要的仪器有： 无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装 有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配 制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培 养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔 化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿 中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。
从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分 子，产生纤维二糖 葡萄糖苷酶 将纤维二糖分解成葡萄糖。
（二）纤维素分解菌的筛选
1.刚果红染色法； 2.刚果红染色法的原理。
四、实验案例
土壤中纤维素分解菌的分离
实验的具体操作步骤如下: 1.土样采集 土样采集的方法与本专题课题2类似。 土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因 为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多 的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环 境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也 会有能分解纤维素的微生物生长。 2.选择培养 选择培养需要的仪器有：250 mL锥形 瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液 管、天平、摇床、温度计等。
1.本实验的流程与课题2中的实验流程 有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如 下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在 以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接 分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤 维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选 择培养基上。其他步骤基本一致。
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素 分解菌？ 答：由于生物与环境的相互依存关系，在富 含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对 提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几 率要高于普通环境。 3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸 应该埋进土壤多深？
培养基的制备参照课本旁栏中的比例配 制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基， 用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外 包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在 121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 选择培养的操作：称取土样20 g，在无 菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将 摇瓶臵于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d， 至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液 进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所 述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯 度稀释和涂布平板。
例1、(20分)某化工厂的污水池 中，含有一种有害的、难于降 解的有机化合物A。研究人员 用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成 功地筛选到能高效降解化合物 A的细菌(目的菌)。实验的主 要步骤如图所示。请分析回答 问题：（北京卷）
(6)实验结束后，使用过的培养基应该 进行 灭菌 处理后，才能倒掉。
5.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微 生物？ 答：在选择培养的条件下，可以使那些能 够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁 殖，而那些不适应这种营养条件的微生物 的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的 作用。
6.学完这个专题后,你能否总结出分离培养微生物 的一般方法?请用流程图表示.
土壤取样 选择培养
2.纤维素酶的结构和作用原理
纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的 葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤 维素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷键连接而成的，淀粉是 由葡萄糖分子按α-1,4糖苷键连接而成的。
内切酶 内切酶作用于无定型的纤维素 （Cx酶） 区域，使纤维素断裂成片段
纤维素酶 外切酶 又叫纤维二糖水解酶，它可以作用 (复合酶) （C1酶） 于纤维素的结晶区或小片段纤维素，
【例题解析】
例1、(20分)某化工厂的污水池 中，含有一种有害的、难于降 解的有机化合物A。研究人员 用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成 功地筛选到能高效降解化合物 A的细菌(目的菌)。实验的主 要步骤如图所示。请分析回答 问题：（北京卷）
(1)培养基中加入化合物A的目的是筛 选 目的菌 ，这种培养基属于 选择 培养基。