功能食品实验指导

功能食品实验指导

实验不溶性膳食纤维提取（4学时）

实验大蒜SOD的制备工艺（4学时）

一、实验目的

1、学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法；

2、熟练掌握操作过程中的操作要点，并能应用到实际生产中。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

三、实验器材

1.仪器或其他用具：电子天平、研磨器、高速离心机、水浴锅、移液枪、50ml试管、分光光度计等。

2.溶液及材料：

（1）磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液；

（2）氯仿－乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇＝3：5（V/V）；

（3）丙酮：用前冷却至4－10℃；

（4）碳酸盐缓冲液：0.05mol/L,pH10.2；

（5）EDTA溶液：0.1mol/L；

（6）肾上腺素液：2mmol/L；

（7）新鲜蒜瓣；

（8）大蒜细胞，通过细胞培养技术获得。

四、实验操作步骤

1．组织或细胞破碎

称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。

2．SOD的提取

将上述破碎的组织或细胞，加入2～3(20-30ml)倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。

3．除杂蛋白

提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。（自己配100 ml）

4．SOD的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。

将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,

离心弃沉淀，得到SOD酶液。

将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

5．SOD活力测定

取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。(ml)

在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应2min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管与样品管的光密度值分别为A 和B。

在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：

酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A

式中N――样品稀释倍数；

2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。

若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算：

酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A ·V/V1＝26·（A－B）·N/A

式中V――反应液体积（6.5ml）；

V1――样品液体积（0.5ml）。

最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化回收率。

五、注意事项

严格控制好各项操作参数，以免酶活力变性失活。

实验茶多酚的制备与检验（4学时）

一、实验目的

使学生体验从茶叶中提取茶多酚的过程，学习沉淀萃取法的原理与工艺流程。

二、实验原理

茶叶茶多酚易溶于热水中，利用茶多酚能与Ca、Hg等金属离子产生络合沉淀的现象将茶多酚从提取液中分离离心出来。在用靛红作指示剂的情况下，样液中能被高锰酸钾氧化的物质基本上都属于茶多酚类物质。根据消耗1mL 0.318g/100mL的高锰酸钾相当于5.82mg茶多酚的换算常数，计算出茶多酚的含量。

三、实验用品

1、仪器和小型用具：

加热回流装置、500ml烧杯、布氏漏斗+减压过滤装置、滤纸、滴管、长搅拌棒、pH试纸（满足pH=4、pH=7两个范围）、天平、药勺、水浴锅、三角瓶、铁架台+滴定管。

2、材料：茶叶(市售绿茶叶末) 共350g

3、试剂：

乙醇(95%食用酒精)、3mol/L氯化钙、3mol/L氯化锌、乙酸乙酯

四、实验步骤

（一）提取工艺流程

原料→粗粉碎→热水浸提→加盐→调pH→离心→弃上清液→稀酸转溶→乙酸乙酯萃取→浓缩干燥

1、原料粉碎

2、热水浸提：原料2.5-25g，与水按照质量比1：10在100℃热水中浸泡，边加热边搅拌。

3、加盐：在浸提液中加入3mol/L氯化钙或3mol/L氯化锌。若无沉淀产生加入一定量的氢氧化钠调节pH。

4、离心：用离心机离心收集滤渣或沉淀。

5、稀酸转溶：加入稀盐酸至沉淀溶解。取部分样品稀释定容进行检测。

6、转溶水液加乙酸乙酯萃取。

7、浓缩干燥：真空干燥。

（二）热水浸提粗品检测

取200mL蒸馏水放在有柄瓷皿中，加入0.1%靛红溶液5mL，再加入供试液5mL。开动搅拌器，用已标定的KMnO4溶液进行连搅拌边滴定，滴定速度不宜太快，一般以1s1滴为宜，接近滴定终

点时再应慢滴。滴定溶液由深蓝色转变为亮黄色为止，记下消耗高锰酸钾的毫升数为A值。

（三）结果计算

茶多酚含量(％)=（A- B）×W×T×0.00582×100/0.318/ m/ V

式中A——样品液消耗的KMnO4量，mL；

B——空白液消耗的KMnO4量，mL；

W一KMnO4浓度，％；

m——样品质量，g；

V——吸取样品液量，mL；

T—提取样品液量，mL。

五、思考题

讨论加盐的种类、调节pH与加盐的测序、pH值等因素对茶多酚沉淀得率的影响。