荧光原位杂交(FISH)
FISH简介
荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, 简称FISH)由于其直观, 快速, 敏感性高和方便灵活越来越得到广泛应用, 尤其是在血液学领域中. 因为白血病标本比较容易取得和制备, 不同类型的白血病又往往有其特异的染色体异常, FISH在白血病诊断, 治疗监测, 预后估计和微小残留病检测等诸方面都正成为不可缺少的重要手段.FISH的基本原理很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况.FISH探针按标记方法可分为直接标记和间接标记: 用生物素(biotin)或地高辛(digoxingenin)标记称为间接标记, 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号, 因而步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大; 直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需要购买荧光抗体, 也由于近年来荧光互的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针越来越成为首选, 采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多钟异常. 其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察, 操作过程中也不需要严格避光, 使FISH过程变得简便而易于操作. FISH并不能取代传统的白血病MCI诊断, 但它却能使MIC分型更为准确和深入. , MIC即细胞形态学(M), 免疫学和细胞遗传学(C), 三者结合对白血病进行分型诊断, 对不同类型的白血病采用不同治疗方案手段. 随着人们对白血病的不断认识, 仅进行MIC分型不够全面, 还要加上对白血病的分子(M)诊断, 成为MICM分型. FISH就是连接细胞遗传学和分子生物学的桥梁.FISH流程仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
染色体荧光原位杂交技术
因为杂交和分带同步进行效果不佳，有 人采用FL(fractional length)来测量。以 杂交信号相对于某固定位置(如端粒)旳长 度占该染色体长度旳百分比来表达。
在不分带旳情况下，特定旳染色体能够 经过着丝粒特异，或端粒特异旳探针进 行共杂交来拟定。复，称为 染色体绘图。
影响杂交成果旳参数有下列几种：探针浓
度，杂交时间，探针大小，杂交温度，
染色质变性条件，染色体旳制备和硬化 程度，RNase作用条件，用于降低背景 旳非特异性竞争DNA和醋酸酐处理．其 中有几种原因影响杂交信号旳强度和特 异性，详细旳讲是DNA探针旳纯度；用 于杂交反应旳探针旳大小．小心掌握好
这些条件，我们就能得到没有荧光背景 旳特异性信号。
1.4 分带和信号定位
• 染色体旳分带能够在杂交前，也能够在杂交后， 高辨别旳染色体标本是取得好旳带形旳基础。常 用旳分带措施有：G(Giemsa)带、Q(Quinacrine) 带、R(Reverse)带，涉及色霉素chromomycin A3 ／偏端霉素distamycin A 法；hoechst33258／ propidium iodide[3，8—二氨基—5—[3—(二乙基 －甲基氨)丙基]6－苯菲碘]法，DAPI[DAPI：4， 6—diamidino，2—phenylindole 2HCl]／ propidium iodide法，染色体旳分带也能够直接用 AluLIHs(LI homo sapiens)或Alu之间旳顺序和染 色体杂交而得到类似R带旳条带，更多旳人在努 力使杂交信号和分带能够同步在显微镜下看到。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列的存在、位置和数量。
该技术通常使用荧光染料标记DNA或RNA的探针来识别特定的序列。
在荧光原位杂交中，常常使用单链DNA或RNA的Oligonucleotide探针。
探针的序列与待检测样品中的特定DNA或RNA序列互相互补，使得探针和样品DNA或RNA序列可以杂交在一起。
探针可以被标记成许多不同的荧光染料，如荧光素、罗丹明等，以使得检测到的探针可根据颜色进行区分。
荧光原位杂交过程包括以下步骤：1. 选择合适的探针。
选择的探针实际上就是一个人工合成的核酸分子，其长度在20-200bp不等，可以与靶序列DNA或RNA中的任意位置相互匹配，检测的种类也包括基因、病毒、染色体等。
2. 标记探针。
标记探针是指把荧光染料等标记物与探针进行化学共价修饰，使之形成标记的探针，标记的探针使用单染色荧光或双染色荧光。
3. 处理样品。
把检测样品进行前处理、处理固定等。
4. 杂交。
把标记的探针打入处理好的样品中，如细胞、组织、染色体等，探针就会与相应的靶分子发生杂交，然后把样品用适当的盐洗。
5. 检测结果。
通过荧光显微镜进行探针的显示，可以看到细胞核内亮相区域，确定靶序列的定位和相应的染色体编号，并可以通过比较实验组和对照组的信号强度，得到目标序列的数量和比例。
荧光原位杂交在基因检测、疾病诊断、癌症诊断和治疗中都有广泛应用。
在基因诊断中，荧光原位杂交可以检测微观缺失、染色体重排列和染色体数目异常等，具有高准确度、高敏感度、高特异性和可显性等特点。
在肿瘤诊断和治疗中，荧光原位杂交是一种高效而准确的技术，可以评估患者的病情、选择合适的治疗方案，预测预后。
因此，荧光原位杂交在生命科学研究和医学诊断中的应用前景非常广阔。
FISH以及免疫荧光的实验步骤
FISH以及免疫荧光的实验步骤FISH（荧光原位杂交）是一种用于检测DNA或RNA序列的实验技术。
该技术结合了传统原位杂交和荧光显微镜技术，可以在细胞或组织样本中定位、标记和可视化特定的DNA或RNA分子。
下面是一个典型的FISH实验的步骤：1.准备标记探针：选择适当的探针来标记目标DNA或RNA序列。
探针通常是短的DNA或RNA片段，与目标序列互补，可以与其发生特异性杂交。
这些探针可以使用不同的标记物进行标记，如荧光染料或辐射性同位素。
2.样品制备：根据需要，制备细胞悬液或组织切片样品。
细胞悬液可以通过离心细胞，将细胞固定在载玻片上。
组织切片可以使用刮片或切片机获得，然后固定在载玻片上。
3.固定样品：将细胞悬液或组织切片固定在载玻片上，以保持细胞或组织的形态结构。
常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。
4. 渗透化处理：使用渗透化剂渗透细胞或组织样品，以增加探针和标记物的进入性能。
常用的渗透化剂包括蛋白酶K和Triton X-100。
5.探针杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA序列结合。
首先在浓度适宜的探针液中孵育样品，使探针与目标序列发生杂交。
温度和时间取决于探针和目标序列的碱基组成和长度，通常需要在高温下进行，以增加探针与目标序列的特异性。
6.杂交后的冲洗：使用适当的缓冲液冲洗样品，以去除未结合的探针和杂交条件中的非特异性结合。
冲洗通常需要进行多次，以确保特异性结合。
7.荧光染色：如果探针是荧光标记的，在杂交后可以直接进行荧光染色。
将样品浸泡在适当浓度的荧光染料中，以标记目标序列。
染色时间通常较短，一般在15-30分钟左右。
8.荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察和记录标记的目标序列的位置和数量。
使用适当的滤光片来选择和分离目标染色的荧光波长。
利用计算机软件，可以对显微镜下的图像进行分析和处理，以获得更多的信息。
在进行FISH实验时，需要注意一些技术细节和注意事项：1.适当的正向和阴性对照是必要的，以确保实验的准确性和可靠性。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
2024荧光原位杂交技术在血液肿瘤中的应用规范(全文)
2024荧光原位杂交技术在血液肿瘤中的应用规范（全文）荧光原位杂交（FISH）技术是基于碱基互补配对原则，利用荧光标记的核酸探针，对待测标本DNA序列进行定位、定性和定量分析的技术，是遗传学异常的主要检测手段之一。
相较于核型分析，FISH技术具有快速、灵敏度高及特异性强的优势，是血液肿瘤诊断和预后判定的重要手段。
为进一步规范FISH技术在血液肿瘤中的应用，中国抗癌协会血液病转化医学专业委员会、中国老年医学学会病理学分会及中华医学会血液学分会组织国内血液学、病理学和检验学专家，制定了FISH 在血液肿瘤中的应用规范。
1 FISH在血液肿瘤诊疗中的应用价值1.1 诊断分型遗传学改变是血液肿瘤诊断分型的主要依据。
急性白血病（AL）、慢性粒细胞白血病（CML）、伴嗜酸粒细胞增多和酪氨酸激酶基因融合的髓系/淋系肿瘤（MLN-TK）、骨髓增生异常综合征（MDS）、大B 细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、伯基特淋巴瘤（BL）、边缘区淋巴瘤（MZL）、间变大细胞淋巴瘤（ALCL）、T幼淋巴细胞白血病（T-PLL）等均需要借助FISH检测关键的遗传学异常才能精准分型。
1.2 预后分层目前针对急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、MDS、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、原发性骨髓纤维化（PMF）、多发性骨髓瘤（MM）等血液肿瘤，世界卫生组织（WHO）、美国国立综合癌症网络（NCCN）指南已提出了基于遗传学异常的预后分层/评分体系。
FISH检测在血液肿瘤的预后评估中发挥着不可替代的作用。
1.3 指导治疗CML患者中费城染色体（Ph染色体）或BCR：：ABL1融合基因的发现开启了酪氨酸激酶抑制剂（TKI）靶向治疗的新时代。
此外，针对PML：：RARA融合基因或其他RARA重排的全反式维甲酸和砷剂、ABL信号通路（ABL1、ABL2、PDGFRA、PDGFRB重排）的TKI药物、JAK-STAT信号通路（CRLF2、JAK1/2/3重排）的JAK抑制剂、FLT3重排的FLT3抑制剂、ALK重排的ALK抑制剂等均已正式应用于临床治疗或处于临床试验阶段。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization，FISH）是一种非常有效的分子生物学技术，用于检测DNA或RNA位点特异性引物与目标序列的杂交，从而直接识别和定位某些具体的DNA序列或RNA序列。
它可以用于细胞内检测和定位指定片段的序列特异性，以及在细胞间，组织切片中检测特定的基因等。
FISH技术最初由美国科学家Edward T. Krick在1980年发展出来，之后又发展出多种改良的技术，如碱基特异性FISH（DNA-FISH）、RNA固定FISH（RNA-FISH）、组织芯片FISH（Tissue Chip FISH）、荧光原位杂交芯片技术（FISH Chip）及基于ROMA的荧光原位杂交（ROMA-FISH）等。
荧光原位杂交技术可以用于研究和检测多种特定的基因或序列，这些基因或序列可能具有调节多种生物过程的功能，如细胞分化、细胞扩增、细胞凋亡、表达特定基因、或影响基因组稳定性，如癌症和其他遗传性疾病等。
FISH技术主要用于检测和定位染色体位点、染色体重组、非特异性和特异性的序列变异，还可以用于诊断疾病、研究发育分化等生物学过程。
荧光原位杂交技术的基本原理是：荧光探针的核酸碱基特异性与目标序列中的碱基结合形成杂交结合物，然后荧光探针发出特定的荧光信号，从而识别和定位目标序列。
FISH技术可以用不同的荧光探针显示出各种不同的颜色，从而检测不同的特定序列。
由于它的高灵敏度和特异性，FISH技术在临床诊断、癌症研究、多基因组学研究和其他生物学研究中得到了广泛应用。
荧光原位杂交技术的具体实施方法包括：（1）设计荧光探针，将其碱基特异性的序列选择性地与目标序列结合；（2）改变荧光探针的位置，使其较为精确地和目标序列结合；（3）观察荧光探针和目标序列结合后所产生的特征荧光信号；（4）对荧光信号进行识别和定位，以及与荧光探针的结合强度等进行估计。
荧光原位杂交技术的应用已经扩展到更多领域，如Karyotyping、FACS Analysis、Flow Cytometry、Chromatin Immunoprecipitation （ChIP）、分子影像学（Molecular Imaging）和系统生物学（Systems Biology）等，它们都是用于研究疾病，以及有助于对疾病的诊断和治疗提供依据的技术。
(完整版)Fish实验
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交)实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法.2。
实验原理荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸.由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列,与靶位结合紧密，杂交信号强,易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP（biotin—dUTP）经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
细胞荧光原位杂交检查
细胞荧光原位杂交检查
细胞荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是一种用于检测细胞内基因组序列的分子生物学技术。
它通过将特定的DNA或RNA探针与目标序列杂交，并用荧光素标记探针，然后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而确定目标序列的位置和数量。
FISH检查可用于研究细胞中基因组序列的改变，如染色体异常、基因扩增、基因缺失等。
它也可用于检测某些基因在特定组织或细胞类型中的表达情况。
下面是FISH检查的一般步骤：
1. 准备探针：根据需要，设计并制备特异性探针，通常为DNA或RNA探针。
2. 制备细胞样品：从组织或细胞培养物中制备样品，一般需要用胰蛋白酶消化、固定等步骤处理细胞。
3. 杂交：将探针与样品中的目标序列进行杂交，一般需要在一定温度和离子强度下进行。
4. 洗涤：去除未结合的探针，减少背景干扰。
5. 荧光素标记：用特定的荧光素标记探针，以便在荧光显微镜下观察。
6. 观察：用荧光显微镜观察杂交信号，并记录目标序列的数量和位置。
FISH检查的优点包括高特异性、高灵敏度、能够准确定位目标序列的位置。
然而，它也存在一些局限性，如需要昂贵的设备和试剂、需要训练有素的技术人员等。
荧光原位杂交
荧光原位杂交目录1荧光原位杂交2荧光原位杂交（FISH）技术详解3荧光原位杂交技术的发展历程1荧光原位杂交简介荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.。
应用背景对于利用rRNA的荧光原位杂交来说，如下原因可导致较低的荧光信号强度：较低的细胞核糖体含量较低的细胞周边的通透性较低的目标序列可接触性（由于rRNA的折叠产生的构象，有些位置与rRNA分子内其他链或其他rRNA或蛋白紧密接触，从而使探针无法和目标序列杂交）为检验细胞中的目标序列是否容易被探针杂交，及测试最佳杂交温度，可利用“克隆荧光原位杂交”(clone-FISH)进行试验：将rRNA基因结合入质粒，转化至大肠杆菌中表达，构成核糖体，再用荧光标记的探针杂交。
FISH可与流式细胞术联用，对特定荧光标记的细胞进行计数或者分离。
[1]变体酶联荧光原位杂交(CARD-FISH)2荧光原位杂交（FISH）技术详解1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。
荧光原位杂交(FISH)检测
目
CONTENCT
录
• 荧光原位杂交(fish)检测概述 • FISH检测的基本原理与技术流程 • FISH检测在临床诊断中的应用 • FISH检测的优势与局限性 • FISH检测的实际案例分析
01
荧光原位杂交(fish)检测概述
定义与特点
定义
荧光原位杂交（FISH）是一种基于荧光标记的DNA探针与目标DNA 结合，通过荧光显微镜观察并检测细胞内特定基因或染色体异常的 技术。
FISH技术可以应用于各种样本类型，如细胞、 组织切片、石蜡包埋组织等。
直接观察
FISH技术可以直接在细胞或组织的显微镜下观 察杂交信号，无需进行额外的染色或标记。
灵敏度高
FISH技术能够检测单个基因拷贝数的变化，灵 敏度较高。
局限性
成本高
FISH技术需要使用特殊的探针和 荧光染料，因此成本较高。
80%
基因突变
FISH技术可以检测基因突变，如 抑癌基因突变、致癌基因突变等 。
基因表达分析
基因表达水平
FISH技术可以检测基因表达水 平，了解基因在细胞中的表达 情况。
基因定位
FISH技术可以确定基因在染色 体上的位置，了解基因的染色 体定位。
基因互作
FISH技术可以检测基因间的相 互作用，了解基因间的关系。
细胞或组织的通透性处理
使用适当的试剂使细胞或组织的膜通透性增加，以便探针能 够进入。
杂交反应
探针与靶DNA的杂交
将制备好的探针与固定在样本上的靶 DNA进行杂交，形成探针-靶DNA复 合物。
去除未结合的探针
通过洗涤去除未结合的游离探针，提 高杂交信号的特异性。
信号检测与图像分析
fish技术在临床上应用
fish技术在临床上应用近年来，随着科技的不断发展，人们在医疗领域也开始尝试运用各种先进的技术手段来提高诊疗水平。
其中，fish技术作为一种新型的遗传学技术，正在逐渐在临床上得到应用。
本文将对fish技术在临床上的应用进行探讨。
fish技术全称为荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization），是一种能够在细胞或组织中定位、检测和鉴定染色体的技术手段。
通过与含有荧光标记的特定DNA或RNA序列杂交，可以使得这些序列在显微镜下呈现出荧光信号，从而达到检测目的。
在临床上，fish技术主要用于以下几个方面：一、染色体异常的检测fish技术在染色体异常的检测中具有独特的优势。
通过对染色体进行特定序列的染色体间的“配对”检测，可以帮助医生及时准确地发现遗传病变，包括染色体缺失、易位、重复等问题。
这对于患者的疾病诊断、治疗和预后都有着重要的指导意义。
二、肿瘤诊断fish技术在肿瘤的诊断和分析中也有着广泛的应用。
通过检测肿瘤细胞中的染色体异常或基因突变，可以帮助医生确认肿瘤的类型、分级和预后，并指导后续治疗方案的制定。
而且，fish技术对于微小残存病灶的检测也非常敏感，能够在临床上提供更精准的诊断信息。
三、遗传病的筛查fish技术在遗传病的筛查中有着重要的应用。
通过对胎儿细胞或新生儿细胞进行fish检测，可以帮助医生早期发现患有遗传病风险的个体，从而及时进行干预和治疗，减少患病的可能性，保障健康。
四、肿瘤治疗监测除了用于诊断外，fish技术还可用于肿瘤治疗的监测。
通过检测肿瘤细胞的染色体异常和基因变异，可以及时了解肿瘤细胞的发展演化情况，判断治疗效果及肿瘤的耐药机制，为调整治疗方案提供依据。
总的来说，fish技术在临床上的应用前景广阔，不仅可以帮助医生更准确、更快速地进行疾病诊断，提高治疗的精准性和有效性，还可以为个体化医疗、精准医学的发展提供技术支持。
然而，需要指出的是，fish技术虽然在临床上有诸多优势，但也存在着检测范围有限、操作流程复杂、成本较高等问题，需要不断进行技术改进和优化。
（完整版）Fish实验
（完整版）Fish实验FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
荧光原位杂交FISH
**用于FISH的探针 1）单拷贝探针： （1）种类：酵母人工染色体（ YAC），细菌人工 染色体 （BAC）， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
**同位素原位杂交的不足： 1）不稳定； 2）高背景； 3）曝光时间长； 4）结果统计学处理繁琐。 5）同位素的使用和处理
1.具有R带带型的正常女性染色体，箭头示杂交 颗粒集中分布于Xp1 1---c1lI 区
2.杂交后R显带的46，Xdic(X)核型，在迟复制的X染色体上有2处被杂交， 为双着丝粒X染色体（小箭头），正常X染色体亦被杂交（大箭头）
第一天（星期一）采血、接种（10:00） 第二天（星期二）培养 第三天（星期三）培养 第四天（星期四）上午7:00 加秋水仙素,(终浓度 0.2ug/ml） 至上午10:00结束培养 制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。 将选好的标本放入50 ℃烤片。
第五天（星期五） 探针变性：75℃水浴5分钟，立即置于0℃ （冰浴中） 5-10分钟。 玻片标本变性： 1. 50℃温箱中2小时 2. 标本在70-75℃，70%甲酰胺/2XSSC中变性 2-3分 钟。 3. 立即脱水，70-90-100%顺序，各5分钟。 4 .室温干燥
同理，采用三种或三种以上不同 的半抗原，如Biotin, DIG和DNP等 标记探针，然后用多种不同颜色的 荧光素，如FITC（绿色）， Rhodamine(红色)，AMA或Cascade Blue(兰色)等结合抗体进行检测， 可同时得到多种不同颜色的荧光信 号，如采用不同的排列组合，最多 可同时检测7种不同的探针。
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3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性Fra bibliotek、定 位准确；
4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度 与放射性探针相当；
5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色 可同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的 变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结 构。
1974 年，Evans第一次将染色体显带技术 和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位 的准确性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交 中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生 物素与RNA 分子连接起来。 1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检 测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。
均匀标记有切口平移法、随机引物法和 PCR扩增等方法。
• 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一 般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 • 该方法使用时应注意： • A. 只能标记双链 DNA 使用探针时要预先变性后再 使用，而且标记时DNA片段不太小 • B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎， 不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口， 使标记物不能进入缺口 • C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不 足，影响杂交的进行
DNA RNA PNA
将探针置于载玻片上 加盖玻片
在荧光显微镜下观察
变性 检测 杂交
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术
2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术
4 原位PCR
荧光原位杂交
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧 光标记取代同位素标记而形成的一种新的 原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫 细胞化学过程连接上荧光染料。
1、不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高
末端标记
直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素 原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复 合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进 行，所以称之为末端标记。
荧光原位杂交的发展前景
FISH技术在遗传学研究中已经取得了不小的成绩， 但是其深度与广度还不够，尤其与生产实践、经 济效益的联系不够紧密。 随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发 展,FISH 技术的应用范围在不断扩展, 今后该技术 在研究细胞核骨架与基因表达的关系,基因转录、 重排、扩增,基因组结构与调控,哺乳动物的染色体 进化研究及亲缘关系等领域将会起到积极的作用。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
杂交步骤和过程 分别由20多步、15h缩减为不到 10步、2h
荧光原位杂交的应用
一、基因定位 二、物理图谱的构建 三、染色体结构分析与数目测定 四、物种起源、进化和亲缘关系研究 五、转基因的细胞学鉴定 六、基因表达分析和临床病毒学检测
奥芬兰海水硝化细菌荧光原位杂交
全菌（采用EUB MIX型探针）
氨氧化细菌（采用NSO1225型探针）
全菌（采用EUB MIX型探针）
亚硝酸盐氧化细菌（采用NIT3型探针）
荧光原位杂交特点
优点
1、荧光试剂和探针经济、安全；
（Fluorescence in situ hybridization,FISH）
主讲：张奎 学院：生物技术学院 学号：222007331212003
原位杂交（ISH）
原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记 的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学 及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于 20世纪60年代。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另 一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
发展历史
1974年Evans首次将染色体显带技术和染 色体原位杂交联合应用，提高了定位的准 确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记 的原位杂交，即FISH技术。 1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列 定位到G显带标本上，标志着染色体定位技 术取得了重要进展。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷 酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放 射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细 胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原 位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的 可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
探针标记
为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂 交，有必要对探针加以标记，以便在结合部 位获得可识别的信号。
荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进 行标记。 探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方 法。
均匀标记
对探针进行标记时，可复制合成一段新探针 分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从 而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特 点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入， 探针的信号强。
1
放射性同位素
3H、35S、125I、32P等
2 2
非放射性物质
荧光素、生物素、地高辛等
同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理
经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更 多的用于RNA S1作图以及引物延伸反应中的标记 引物。
染色体显带
显带染色是将染色体经 过一定程序的处理,并用 特定的染料染色后,使染 色体在其长轴上显示出 一个个明暗交替或深浅 不同的横纹,这样的横纹 就叫做染色体的带。
缺点 1、不能达到100%杂交，特别是在应 用较短的cDNA探针时效率明显下降。 2、必须在已知探针的情况下方可进行。
FISH技术新进展
随着FISH的广泛应用，FISH本身也得到长足进步。 这主要表现在以下几个方面： 探针 由最初的每次杂交用一种探针发展为每次杂 交用多种探针，即由单色荧光原位杂交发展为多色 荧光原位杂交 标记物质 由单一的几种发展为现在的几十种
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基 顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度 为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易 渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小， 限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数 目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此 这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重 复序列的荧光原位杂交分析。
食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析
每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一 定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每 条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色 体显带。 染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效 的方法。
染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体 的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。
20世纪90年代，随 着人类基因组计划 的进行，由于绘制 高分辨人类基因组 图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的 发展和广泛应用。
FISH样本的制备 探针的制备 探针标记 杂 交
（染色体显带） 荧光显微镜检测 结果分析
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利 用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进 行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位 杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要 采用放射自显影进行检测,这种检测上的限 制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原 位杂交技术不能很快得到广泛应用。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。