高产纤维素酶菌株的诱变育种

湖南农业大学课程论文学院：生物科学技术学院班级：姓名：学号：课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种课程名称：工业微生物育种学评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期：年月日纤维素酶高产菌株的诱变育种( )【摘要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。

近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。

本文对这些研究进展进行了归纳和总结.【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种Mutation Breeding of Cellulase High-yield StrainTAO Mi-lin(College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Hunan 410128)【Abstract】Cellulase is a kind of complex enzyme. Due to the ability of hydrolyzing cellulose or the similarity of cellulose into glucose. A great effort has been made until now on the research such as identification, mutation breeding and filter of cellulose-producing strain. This paper focused a brief induction and summary on advancing about these aspects.【Key words】cellulose-producing strain ; cellulase ; filter ; mutation breeding随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。

寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。

纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。

地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。

另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。

如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。

纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。

因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。

另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。

1、纤维素酶纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。

1.1 纤维素酶的结构不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。

纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanases，EC3.2.1.4，简称EG)、葡聚糖外切酶(exo-1,4-β-D-glucanases，又称纤维二糖水解酶，cellobiohydrolases，EC3.2.1.91，简称CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidases，简称BG)3种水解酶组成的一个复杂酶系，其简要作用模式见附表。

1.2 纤维素酶的作用机理纤维素酶中单酶系的作用机理与溶菌酶类似，遵循双置换机理，其复合体水解纤维素的精确机制目前也还不清楚，但有一点已有报道，复杂多酶复合体的四级结构是其发挥作用的关键，并且取决于葡聚糖内切酶的协同作用和复合酶与底物表面的聚集作用。

纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。

由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。

纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。

1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。

协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由Cx酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。

不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。

若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。

1.3 纤维素酶的用途1.3.1 食品发酵工业食品发酵工业是纤维素酶应用最广泛的一个部门。

利用纤维素酶处理原料，可改变细胞壁的通透性，提高细胞内含物（如蛋白质、淀粉、油脂、糖等）的提取率，改善食品质量，简化生产工艺；用纤维素酶处理大豆，可促使脱皮，增加从大豆提取蛋白质的得率，亦可回收豆渣中的蛋白质和油脂；用于淀粉制造，可缩短时间，增加得率；用于柑桔果汁加工，可促进汁液的提取和澄清；用于酱油酿造，可改善酱油质量，缩短生产周期，提高产量；用于造酒工业，可提高出酒率。

1.3.2 生产萄萄糖和单细胞蛋白(SCP)农副产品和城市废料中的纤维素，通过纤维素酶转化为葡萄糖和单细胞蛋白，对人类有着十分重要的意义。

美国NatiR研究所的Mandels等人利用雷斯木霉的培养滤液作用于纸浆，球磨新闻纸，日本的外山信男等人使用商品酶制剂作用于经前处理（去除木质素）的稻草粉和新闻纸粉末，所得10%和9%的糖液可作为发酵工业的原料来生产酒精、SCP等发酵产品。

利用纤维素酶发酵生产单细胞蛋白主要有两种方法：一种是先将纤维素经酶糖化后再培养酵母等微生物生产SCP；另一种是直接利用某些纤维素分解菌混合发酵生产SCP，如利用纤维单细胞菌等，可直接由纸厂纤维废料发酵生产单细胞蛋白。

1.3.3 饲料工业纤维素酶和纤维素酶产生菌能转化粗饲料如麦桔、麦糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分纤维素转化为糖、菌体蛋白、脂肪等，降低饲料中粗纤维含量，提高粗饲料营养价值、扩大饲料来源。

近年来，国内正努力开发饲料用复合酶,它主要以纤维素酶为主另加蛋白酶、果胶酶、半纤维素酶、淀粉酶、溶菌酶等，当添加入饲料中，能大幅度提高饲料的可消化性及营养。

1.3.4 其它用途纤维素酶在医药方面也具有用途，它与淀粉酶、蛋白酶一样可作为消化剂使用, 目前，日本已有含纤维素酶的消化剂出售。

在环境保护方面，利用纤维素酶可消除下水道中污物，把纤维素酶添加入清洗剂中，可增加清洗剂的效果。

在遗传工程方面，可利用纤维素酶来溶解植物细胞壁，进行植物细胞融合及水稻杂交育种。

2、纤维素酶的诱变育种2.1 纤维素酶的产生菌纤维素酶的来源非常广泛, 昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。

目前研究较多的是霉菌, 其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉, 特别是里斯木霉、绿色木霉、康氏木霉等较为典型,是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。

细菌中酶活力较强的菌种有纤维粘菌属、生抱纤维粘菌属和纤维杆菌属, 放线菌中有黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌和白玫瑰放线菌等。

2.2 纤维素酶产生菌的诱变方法2.2.1 紫外线(UV)诱变用无菌水洗下经活化的斜面孢子，于玻珠小三角瓶中振荡20 min后用3层镜头纸过滤，适当稀释，制成每毫升含105一107个孢子的菌悬液．打开紫外线灯(30W)预热20 min，取8份5 mL的菌悬液置于离紫外线灯30 cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上照射1 min，然后打开培养皿盖分别照射1、3、5、7、9、1l、13、15 min．诱变菌液在黑暗中冷藏保存1—2 h，再接种于PDA平板上进行初筛。

2.2.2硫酸二乙酯(DES)诱变在2.2.1配好的菌悬液中加入DES稀液(DES原液l mL+95％乙醇4mL)0．25 mL，振荡40 min，适当稀释后涂PDA平板，挑选单菌落用于初筛。

2.2.3 复合交替诱变分别选取紫外线最佳照射时问与硫酸二乙酯最佳处理时间进行复合诱变。

具体方法：先按照2.2.2用DES对ZM-4的孢子悬液进行诱变后，再按2.2.1所示用紫外灯对其诱变，如此交替进行。

重复5次交替诱变后，将处理液进行梯度稀释并涂布于纤维素刚果平板培养基中，于30℃培养4d。

2.2.4 微波诱变用生理盐水稀释至10的6-7次方个每毫升的孢子悬液，采用低温分散法于2450MHz微波炉，700W功率下辐射30s—3min后采用10倍稀释法稀释，分别涂平板，30℃培养。

2.2.5 亚硝基胍诱变选取经UV 诱变后酶活最高的突变株为出发菌株，按2.2.1方法制备孢子悬浮液。

取孢子液10 ml，加入10 ml NTG(4 mg/ ml)，28 ℃恒温振荡处理5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60 min 后，适当稀释，涂布于筛选培养基平板中，28℃培养4 ～5 d 后，计算菌落数量和NTG 致死率。

2.3 纤维素酶产生菌的筛选2.3.1 简要流程2.3.2 具体流程(1)富集培养：取土壤样品5.0 g，加入到45mL无菌水中，振荡均匀，静置取2 mL 上清液注入盛有20 mL富集培养基的50 mL三角瓶中，恒温振荡器30℃、150 r／min振荡培养48 h。

(2)初筛：取1 mL富集培养菌液涂布于铺有初筛培养基的平板上，28℃、倒置培养72 h，观察水解圈产生情况,并挑取有水解圈的菌落转接至斜面培养基培养，保存。

(3)复筛：初筛得到的菌株活化后，各挑取一环分别接种到80 mL（250 mL三角瓶)复筛培养基中，在恒温振荡器中30℃、150 r／min振荡培养48 h，将发酵液以5 000 r／min离心20 min，得粗酶液，采用DNS法分别测其半纤维素酶的活性，从而筛选出产酶活力最高的菌株。

2.4 纤维素酶活的测定方法2.4.1 CMC酶活力(CMCase)的测定方法取0.5mL适当稀释的酶液，加入1.5mL 0.625%CMC溶液，于50℃保温5min，加人2mLl0％的氢氧化钠溶液终止反应，再加入3mLDNS试剂，于沸水中煮15min，迅速冷却后于550nm处比色。