人干扰素a2b生产工艺
重组人干扰素α2b的制备研究
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第３期㊀２１２~２１８ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０１６￣０１￣２４ꎻ接受日期:２０１６￣０３￣１５㊀作者简介:梁果义ꎬ副研究员ꎬ主要从事生物制品的研发ꎮＴｅｌ:０１０￣６８７２７１２７ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉａｎｇｇｕｏｙｉ＠ｓｌｐｈａｒｍ.ｃｏｍ.ｃｎ重组人干扰素α２ｂ的制备研究梁果义ꎬ㊀刘晓航北京双鹭药业股份有限公司ꎬ北京１０００４３摘㊀要:为了获得高活性高纯度的ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ对重组人干扰素α２ｂ进行克隆㊁表达ꎬ并深入研究了其纯化工艺ꎮ采用重叠延伸ＰＣＲ法合成了编码ＩＦＮα２ｂ的基因ꎬ用ＤＮＡ重组技术构建了原核表达载体ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎬ获得了稳定的工程菌种ꎮ发酵产物通过破菌㊁洗涤获得包涵体ꎬ再经过变性㊁复性㊁离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化ꎬ得到ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品ꎬ其比活可达１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎮ实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础ꎮ关键词:干扰素α２ｂꎻ制备ꎻ表达ꎻ纯品ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０３.１１ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂＬＩＡＮＧＧｕｏ￣ｙｉꎬＬＩＵＸｉａｏ￣ｈａｎｇＣｏｍｐａｎｙＰｒｏｆｉｌｅｏｆＢｅｉｊｉｎｇＳＬＰｈａｒｍꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００４３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｏｂｔａｉｎｉｎｇｒｈＩＦＮα２ｂｗｉｔｈｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｕｒｉｔｙ.ＯｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒＩＦＮα２ｂ.ＡｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｒｈＩＦＮα２ｂｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ.ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎＤＨ５α.Ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎꎬｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅｌｌｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｌｙｓｅｄ.ＦｉｎａｌｌｙꎬｔｈｅｒｈＩＦＮα２ｂｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎꎬｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎꎬｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬａｎｄｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂꎻｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇꎻｐｕｒｉｆｙ㊀㊀干扰素是一类重要的细胞因子ꎬ具有普遍的生物学功能ꎬ可以抵抗病毒感染ꎬ影响细胞生长㊁分化和调节生物机体免疫的功能ꎮ它在疾病的临床治疗上使用数年ꎬ在治疗病毒性感染㊁癌症和多发性免疫疾病等方面都有广泛的应用ꎮ目前世界上包括中国在内的５０多个国家已批准干扰素上市ꎬ治疗约３０多种疾病ꎬ如慢性乙型肝炎(ＣＨＢ)㊁ＳＡＲＳ病毒㊁毛细胞白血病㊁尖锐湿疣㊁艾滋病患者的卡波济肉瘤㊁慢性肉芽肿瘤㊁病毒性红眼病㊁病毒性角膜炎㊁唇和生殖器疱疹㊁水痘㊁慢性宫颈炎和巨细胞病毒病[１~４]等ꎮ目前所报道过的干扰素按照细胞结构和来源可分为α㊁β㊁γ干扰素３个型别ꎬα干扰素又称人白细胞干扰素ꎬ它是由Ｂ淋巴细胞和单核细胞产生的ꎮα干扰素亚型至少有２３种ꎬ成簇分布于人第９号染色体的ｐ２２区ꎬ总长度１~２ｋｂꎬ没有内含子ꎮ干扰素α２ｂ是由１６５个氨基酸残基组成的单链多肽[３]ꎬ理论值分子量为１９２３７Ｄａꎬ含４个Ｃｙｓ残基ꎬ形成２个分子内二硫键(Ｃｙｓ１和Ｃｙｓ９８㊁Ｃｙｓ２９和Ｃｙｓ１３８)ꎬ其中Ｃｙｓ２９和Ｃｙｓ１３８之间的二硫键对ＩＦＮα２ｂ形成特定的立体结构和表现生物活性非常重要[５ꎬ６]ꎮＩＦＮα２ｂ等电点在ｐＨ５~６之间ꎬ在ｐＨ２.５的溶液中稳定ꎬ在０.１％ＳＤＳ溶液中稳定ꎬ对热亦稳定ꎬ对各种蛋白酶敏感ꎮ天然α干扰素无糖基化位点ꎮ目前已有４０ｋＤａＰＥＧ修饰的ＩＦＮ￣α２ａ(Ｐｅｇａｓｙｓ )和１２ｋＤａＰＥＧ修饰的ＩＦＮ￣α２ｂ. All Rights Reserved.(ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ Ｓｈｅｒｉｎｇ￣Ｐｌｏｕｇｈ)应用于临床ꎬ这两类产品都能够延长ＩＦＮ￣α在体内的半衰期ꎮ然而ꎬＰＥＧ修饰的ＩＦＮ￣α在体外的抗病毒活性较之未经修饰的ＩＦＮ￣α都有所降低[７]ꎮ修饰过的干扰素延长半衰期ꎬ改进药物治疗的有效性和耐受性ꎮ干扰素的制备是干扰素药物研发的一个难点ꎮ虽然包涵体复性过程繁琐㊁收率低ꎬ但是表达量高㊁成本低㊁生产周期短ꎬ干扰素通常以大肠杆菌包涵体的形式表达ꎮ本研究通过基因工程方法拼接成功构建了原核表达载体ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎬ获得了工程菌种ꎬ改进了纯化方法ꎬ加入凝胶过滤层析ꎬ制备高纯度的样品ꎬ提高了生物活性ꎬ以期为进一步开展药学研究和长效制备提供依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料ＤＨ５α感受态细胞为全式金生物技术有限公司产品ꎬ质粒ｐＢＶ２２０为本实验室保存ꎬＤＮＡ片段由北京三博远志生物技术有限责任公司合成ꎻ核酸纯化试剂盒㊁质粒提取试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品ꎻ低分子量核酸标记物ＴａＫａＲａＤＬ２０００㊁ｄＮＴＰ㊁各种限制性内切酶㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶为ＴａＫａＲａ公司产品ꎻｐｆｕＤＮＡ聚合酶为ＴｉａｎＧｅｎ公司产品ꎻ氨苄青霉素为石药集团产品ꎻＴｒｉｓ为Ｐｒｏ￣ｍｅｇａ公司产品ꎻＳＤＳ㊁丙烯酰胺㊁甲叉双丙烯酰胺为Ｓｉｇｍａ公司产品ꎻＴｒｙｐｔｏｎｅ㊁Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ为ＯＸＩＯＤ公司产品ꎻ结晶紫为北京旭东化工厂产品ꎻＲＰＭＩ１６４０为ＧＢＩＣＯ公司产品ꎻ其余为国产分析纯试剂ꎮＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ㊁ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００均为ＧＥ公司产品ꎬ其他溶液配方见表１ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀ＩＦＮα２ｂＤＮＡ片段的合成㊀ＤＮＡ片段的设计参考魏开坤等[８]重组人干扰素α２ｂ的基因序列ꎬ根据实验设计把α２ｂ全基因分成１６个片段ꎬ即Ａ１~Ａ１６个序列(表２)ꎬ接着以顺序拼接成整条寡核苷酸ꎬ相临的片段之间均包含一部分重叠序列ꎬ并在Ｎ末端和Ｃ末端相应导入限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ㊁ＳａｌⅠ的酶切位点ꎮ表１㊀本研究所用到的溶液配方Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｍｕｌａｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ.溶液名称配方ＬＢ培养基胰蛋白胨１０ｇ/Ｌꎬ酵母提取物５ｇ/ＬꎬＮａＣｌ１０ｇ/ＬꎬｐＨ７.５裂解缓冲液２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ４ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０包涵体洗涤液Ａ２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ１ｍｏｌ/Ｌ尿素ꎬ１％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ０.１５ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０包涵体洗涤液Ｂ２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ２ｍｏｌ/Ｌ尿素ꎬ１％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ０.１５ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ２ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０变性缓冲液１００ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ６ｍｏｌ/Ｌ盐酸胍ꎬ０.１５％β￣巯基乙醇复性缓冲液２０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ０.５ｍｏｌ/Ｌ甘氨酸ꎬ０.１５％ＰＥＧ￣６０００ꎬ４ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡꎬｐＨ８.０平衡缓冲液Ａ１０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ８.０洗脱缓冲液Ａ１０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ０.２ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬｐＨ８.０平衡缓冲液Ｂ２０ｍｍｏｌ/ＬＰＢꎬ０.１５ｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬｐＨ７.０㊀㊀利用重叠延伸ＰＣＲ法进行ｒｈＩＦＮα２ｂ全基因合成ꎮ延伸ＰＣＲ法扩增ＩＦＮα２ｂ流程:①将片段Ａ１~Ａ４㊁Ａ５~Ａ８㊁Ａ９~Ａ１２㊁Ａ１３~Ａ１６四四混合ꎬ配制ＰＣＲ反应混合物进行ＰＣＲ延伸ꎮ将Ａ１~Ａ４㊁Ａ５~Ａ８㊁Ａ９~Ａ１２㊁Ａ１３~Ａ１６各组ＰＣＲ产物标记为Ｂ１㊁Ｂ２㊁Ｂ３㊁Ｂ４ꎮ②将Ｂ１㊁Ｂ２作为核心模板ꎬＡ１㊁Ａ８作为两头的引物ꎻ将Ｂ３㊁Ｂ４作为核心模板ꎬＡ９㊁Ａ１６作为两头的引物ꎻ配制ＰＣＲ反应混合物ꎬ进行ＰＣＲ延伸ꎮ将Ｂ１㊁Ｂ２㊁Ａ１㊁Ａ８组和Ｂ３㊁Ｂ４㊁Ａ９㊁Ａ１６组ＰＣＲ产物标记为Ｃ１㊁Ｃ２ꎮ将Ｃ１㊁Ｃ２作为核心模板ꎬＡ１㊁Ａ１６作为两头的引物ꎬ配制ＰＣＲ反应混合物ꎬ进行ＰＣＲ循环ꎮ１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ最终扩增产物[９]ꎮ１.２.２㊀表达质粒ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ的构建㊀通过３１２梁果义ꎬ等:重组人干扰素α２ｂ的制备研究. All Rights Reserved.表２㊀α２ｂ基因片段序列Ｔａｂｌｅ２㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆα２ｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔ.序列名称序列(５ᶄң３ᶄ)Ａ１５ᶄ￣ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣ￣３ᶄＡ２５ᶄ￣ＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧ￣３ᶄＡ３５ᶄ￣ＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧ￣３ᶄＡ４５ᶄ￣ＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＣＧＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧ￣３ᶄＡ５５ᶄ￣ＧＧＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣ￣３ᶄＡ６５ᶄ￣ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧ￣３ᶄＡ７５ᶄ￣ＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣ￣３ Ａ８５ᶄ￣ＧＧＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＧＧ￣３ᶄＡ９５ᶄ￣ＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣ￣３ᶄＡ１０５ᶄ￣ＧＧＴＴＴＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＴＣＡＡＣ￣３ᶄＡ１１５ᶄ￣ＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＡＣＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣ￣３ᶄＡ１２５ᶄ￣ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣ￣３ᶄＡ１３５ᶄ￣ＣＧＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧ￣３ᶄＡ１４５ᶄ￣ＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＡＧ￣３ᶄＡ１５５ᶄ￣ＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＧＴＴＣ￣３ᶄＡ１６５ᶄ￣ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＣＧＣＡＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣ￣３ᶄ琼脂糖凝胶电泳回收目的基因ＩＦＮα２ｂ的ＰＣＲ产物ꎬ与表达载体ｐＢＶ２２０进行ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切ꎬ于３７ħ酶切３ｈꎬ回收备用ꎮ目的片段经过内切酶ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ消化ꎬ将消化后的目的片段ＩＦＮα２ｂ和同样酶切后载体ｐＢＶ２２０的连接体系混合ꎬ产物于４ħ孵育过夜ꎮ取部分连接体系热转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎮ３２ħ孵育０.５ｈꎬ涂布于含相应抗性的ＬＢ平板ꎬ平板置于超净台晾干ꎮ３２ħ培养箱过夜培养ꎮ挑取克隆ꎬ经过质粒小量制备后ꎬ进行ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切ꎬ于３７ħ酶切３ｈꎬ１％琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应产物ꎮ阳性菌落菌种保藏后测序ꎮ１.２.３㊀重组ｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂ的表达验证㊀将阳性菌落按照１％比例接种到含５０μｇ/ｍＬ氨苄青霉素的新鲜ＬＢ培养基中ꎬ于３２ħꎬ２００ｒ/ｍｉｎ培养３ｈꎬ升温至４２ħꎬ继续培养４ｈꎮ于６０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ收获菌体沉淀ꎬ向沉淀中加入１００μＬ水重悬ꎬ取１０μＬ加入１０μＬ２ˑＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沸水浴５ｍｉｎꎬ取１０μＬ上样ꎮ把上述方法诱导表达后获得的菌体沉淀重悬ꎬ超声破碎ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ分别取上清㊁沉淀ꎬ１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ观察目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况ꎮ１.２.４㊀基因工程菌ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ/ＤＨ５α的发酵培养㊀一级种子培养:将１５０ｍＬ甘油保存菌接种于装有１００ｍＬＬＢ液体培养基(Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ１００μｇ/ｍＬ)的２５０ｍＬ三角瓶中ꎬ于３２ħꎬ２００ｒ/ｍｉｎ培养约１０ｈꎮ二级种子培养:以１２０μＬ/２００ｍＬ的接种量接种一级种子培养液于１０个装有２００ｍＬＬＢ液体培养基(含氨苄青霉素１００μｇ/ｍＬ)的５００ｍＬ三角瓶中ꎬ于３２ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ培养约１２ｈꎮ发酵:发酵罐工作容积:２０Ｌꎻ种子液接种量:１０％ꎬ共２Ｌꎮ按１０％接种量将二级种子培养液接种到３０Ｌ发酵罐中进行培养ꎬ发酵体积为２０ＬꎬｐＨ控制在７.００ʃ０.０５ꎬ通过发酵控制系统自动补加５ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ调节ｐＨꎮ温度控制在３２ħꎬ溶氧控制在３０％以上ꎬ培养过程中可通过提高通气量和搅拌速度来提高溶氧量ꎮ发酵过程中定时取样检测细菌密度和培养基中的葡萄糖含量ꎮ培养菌株至ＯＤ６００约为３.５时ꎬ培养基中的葡萄糖几乎消耗完毕ꎬ以２ｍＬ/ｍｉｎ的流速滴加补料４１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.液ꎬ培养至ＯＤ６００约为４时ꎬ迅速升温至４２ħꎬ热诱导表达３ｈꎬ离心收集湿菌体ꎮ１.２.５㊀重组蛋白ｒｈＩＦＮα２ｂ的分离纯化[１０]㊀表达后菌液的处理:按２００ｇ发酵湿菌体加４Ｌ起始缓冲液ꎬ均匀悬浮细菌后ꎬ进行超声破碎ꎬ１Ｌ/次ꎬ１２００Ｗꎬ超声１ｓꎬ间隙１ｓꎬ４０ｍｉｎꎮ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集包涵体沉淀ꎮ将包涵体沉淀分别用包涵体洗涤液Ａ㊁包涵体洗涤液Ｂ㊁起始缓冲液洗涤一次ꎬ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集包涵体ꎮ将包涵体沉淀用包涵体缓冲液溶解(１０ｍＬ/ｇ包涵体沉淀)ꎬ４ħ搅拌过夜ꎬ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ即为包涵体变性液ꎮ包涵体蛋白的复性:在缓慢磁力搅拌下ꎬ将包涵体变性液以１ʒ１００(Ｖ/Ｖ)加入到复性缓冲液中ꎬ完全加入后静置４ｈꎮ复性蛋白的透析:将复性蛋白装入处理好的透析袋(截留分子量为１４ｋＤａ)ꎬ完全浸入２０倍样品体积的１０ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ８.０透析液中透析２４ｈꎮ其间可更换３次透析液ꎮ透析完成后收集蛋白溶液ꎬ８０００ｒ/ｍｉｎ离心２０ｍｉｎꎬ收集上清液备用ꎮＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析:用平衡缓冲液Ａ对层析柱进行平衡ꎬ使得流出液的电导㊁ｐＨ和平衡缓冲液Ａ一样ꎬ将透析离心后所获得的目的样品上样ꎮ用平衡缓冲液Ａ淋洗ꎬ去除非特异性吸附的蛋白ꎮ用洗脱缓冲液Ａ进行洗脱ꎬ流速为０.５ｍＬ/ｍｉｎꎮ用１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳对收集的样品进行检测ꎮ把收集的样品用超滤的方法进行浓缩处理ꎬ准备下一步纯化ꎬ选择截留分子量为５０００ｋＤａ的膜包ꎮＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００凝胶过滤层析:用平衡缓冲液Ｂ对层析柱进行平衡ꎬ使得流出液的电导㊁ｐＨ和平衡缓冲液Ｂ一样ꎬ将超滤浓缩后所获得的目的样品上样ꎮ用平衡缓冲液Ｂ进行洗脱ꎬ流速为１ｍＬ/ｍｉｎꎬ分段收集ꎮ用１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳对收集的样品进行检测ꎮ１.２.６㊀蛋白含量测定㊀蛋白质含量测定使用Ｌｏｗｒｙ法(即Ｆｏｌｉｎ￣酚法)[１１]ꎮ精密称取牛血清白蛋白ꎬ用水溶解成不同的浓度作为标准蛋白质溶液ꎬ取一定量的样品适当稀释ꎬ测得样品吸光度ꎮ以标准品蛋白质浓度为横坐标ꎬ吸光度为纵坐标绘制标准曲线ꎬ将样品对应的吸光度代入直线回归方程ꎬ计算样品的蛋白质含量ꎮ１.２.７㊀体外生物活性测定㊀采用细胞病变抑制法测定干扰素的体外生物学活性[１２]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重叠延伸ＰＣＲ法合成ＩＦＮα２ｂｃＤＮＡ经过三步重叠ＰＣＲꎬ最终检测结果见图１ꎬ可见ＰＣＲ产物在５００ｂｐ左右出现了谱带ꎮ条带清晰ꎬ大小与设计相同ꎬ可用于后续构建实验ꎮ图１㊀干扰素α２ｂ的ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ.１㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＩＦＮα２ｂ.Ｍ:ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:重叠ＰＣＲ扩增的ＩＦＮα２ｂ２.２㊀提取质粒后进行双酶切对阳性重组子的验证挑取转化后平板中的克隆子ꎬ培养后利用质粒提取试剂盒提取质粒ꎬ用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ꎬ在５００ｂｐ左右的位置ꎬ泳道２出现了谱带(图２)ꎬ证明质粒中插入基因与目的基因大小相同ꎬ说明质粒构建成功ꎮ２.３㊀对阳性克隆重组子的诱导表达验证对阳性菌落进行测序ꎬ测序结果与设计相同ꎮ进行诱导表达验证ꎬ并进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ结果见图３ꎮ与诱导前相比ꎬ诱导后蛋白表达明显ꎬ且与α２ｂ标准品大小相同ꎬ证明菌种可表达α２ｂ蛋白ꎮ分别取菌体沉淀超声破碎后的上清和沉淀进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ结果证实其为包涵体表达ꎮ２.４㊀基因工程菌ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ/ＤＨ５α的发酵培养３批发酵的湿菌体进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析ꎬ电泳图谱见图４ꎮ可见蛋白表达明显ꎬ该菌种５１２梁果义ꎬ等:重组人干扰素α２ｂ的制备研究. All Rights Reserved.图２㊀ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ酶消化Ｆｉｇ.２㊀ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ.Ｍ:ＤＬ１００ＰｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐＢＶ２２０ꎻ２:ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂ图３㊀ｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂ诱导表达Ｆｉｇ.３㊀ＩｎｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂ.１:未经诱导的ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎻ２:热诱导的ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎻ３:标准蛋白ｒｈＩＦＮα２ｂ图４㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ表达的电泳检测Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙ１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ.Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１~３:３批发酵菌体的总蛋白可用于发酵制备α２ｂ蛋白ꎮ电泳检测３批样品中ꎬ在分子量２０ｋＤａ左右的位置都有明显的一条蛋白条带ꎬ同目的蛋白的分子量一致ꎬ此发酵工艺稳定ꎬ能够获得目的蛋白ꎮ２.５㊀重组蛋白ｒｈＩＦＮα２ｂ的分离纯化２.５.１㊀表达后菌液处理的电泳分析结果㊀按实验１.２.５方法ꎬ菌种经发酵培养ꎬ菌体破碎ꎬ包涵体洗涤ꎬ各阶段进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析ꎬ电泳图谱见图５ꎮｒｈＩＦＮα２ｂ的分子量为１９.２ｋＤａꎬ在对照品２２ｋＤａ和１４ｋＤａ之间有一条明显的蛋白条带ꎬ即为ｒｈＩＦＮα２ｂ的表达产物ꎮ目的蛋白存在于离心沉淀中ꎬ破菌上清中没有ꎬ说明目的蛋白以包涵体形式表达ꎮ图５㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ包涵体的电泳检测Ｆｉｇ.５㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ.Ｍ:低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１:重组大肠杆菌的总蛋白ꎻ２:重组大肠杆菌的可溶性蛋白ꎻ３~５:经包涵体洗涤液Ａ~Ｃ冲洗后的重组大肠杆菌非可溶性蛋白２.５.２㊀ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析及电泳分析结果㊀将ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析洗脱收集的样品做１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ观察每一步层析的洗脱情况及其纯度ꎬ电泳结果见图６ꎮ图６㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ离子交换层析的电泳检测Ｆｉｇ.６㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｏｎＩＥＣ.Ｍ:低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ峰值蛋白２.５.３㊀ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００凝胶过滤层析及电泳分析结果㊀按照ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００凝胶过滤层析的蛋白出峰情况分段收集的样品进行１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测ꎬ观察各个样品中蛋白条带的分布情况及其纯度ꎬ电泳图谱见图７ꎮ分析ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ洗脱液的电泳检测结果ꎬ除了目的蛋白条带还有２~３条杂蛋白ꎬ而且分子量大于目的蛋白ꎬ可以尝试凝胶过滤层析的方法进一步分离ꎮ凝胶过滤层析分段６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.收集１０瓶ꎬ第７~１０瓶没有杂蛋白ꎬ可以合并保存ꎮ２.５.４㊀蛋白质收率㊀蛋白质粗提过程中ꎬ每取２００ｇ湿菌体ꎬ获包涵体５０ｇꎬ包涵体变性液５００ｍＬꎬ可分批复性ꎮ每２００ｇ湿菌体可获ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品２１８ｍｇꎮ蛋白质复性后各步蛋白含量㊁活性等情况见表３(３批复性结果)ꎮ对比３批的实验结果ꎬ生物活性都达到了１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎬ目的蛋白活性稳定ꎬ回收率可达４.０％以上ꎬ此工艺可行ꎬ能够用于放大生产工艺的开发ꎮ图７㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ凝胶层析的电泳检测Ｆｉｇ.７㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈＩＦＮα２ｂｏｎＧＦＣｂｙ１５％ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ.１~１０:分段收集的蛋白片段表３㊀ｒｈＩＦＮα２ｂ纯化结果Ｔａｂｌｅ３㊀ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒｈＩＦＮα２ｂ.Ｌｏｔ方法总体积(ｍＬ)蛋白质含量(ｍｇ/ｍＬ)蛋白质(ｍｇ)活性(ˑ１０１０ＩＵ)比活(ˑ１０７ＩＵ/ｍｇ)蛋白产量(％)活性产量(％)纯化(Ｘ￣ｆｏｌｄ)１２３复性４７０００.１７５８２３１.９８２.４５００００.１７０８５０２.１３２.５４５０００.１９５８７８２.０２２.３１２３离子交换层析１９００.８７２１６６１.３３８.０２０.２６７.２３.３２０００.８１６１６３１.３２８.１１９.２６２.０３.２２４００.８０８１９４１.５１７.８２２.１７４.８３.４１２３凝胶过滤层析１０２０.３２１３２.７０.３６１１４.０１８.２４.６１１００.３１９３５.１０.３５１０４.１１６.４４.０１０４０.３５３３６.７０.３７１０４.２１８.３４.３３㊀讨论采用了重叠延伸ＰＣＲ法成功合成了ｒｈＩＦＮα２ｂ基因ꎬ构建了表达质粒ｐＢＶ２２０￣ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ表达产物ｒｈＩＦＮα２ｂ在大肠杆菌ＤＨ５α中以包涵体的形式存在ꎬ蛋白表达量可占全菌蛋白的２３％~３２％ꎮ发酵产物通过破菌㊁包涵体抽提㊁变性㊁复性㊁阴离子交换层析ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ以及凝胶过滤层析ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００的纯化方法ꎬ得到纯品ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ比活达到１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎬ每２００ｇ湿菌体可获ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品２１８ｍｇꎮ本实验在进行ＰＣＲ时ꎬ将相邻片段两两互补延伸以后ꎬ再与相邻片段互补延伸ꎬ最后是两个大片段拼出全长基因ꎬ虽然步骤较多ꎬ但ＰＣＲ效果较好ꎬ显示出良好的应用前景ꎮ包涵体是指通过基因工程技术ꎬ大肠杆菌表达的重组蛋白在细胞内凝集ꎬ形成没有活性的固体颗粒ꎮ本实验包涵体洗涤中ꎬ采用低浓度的尿素能溶解部分杂蛋白ꎬＴｒｉｔｏｎＸ￣１００能溶解脂质和脂膜蛋白ꎮ有文献报道ꎬ在复性过程中ꎬ会出现大量的二聚体ꎬ可能是一级结构错配造成的ꎬ一般采用离子交换和疏水层析的方法纯化[１３]ꎮ本实验重新优化了菌种ꎬ采用两步色谱法分离纯化ｒｈＩＦＮα２ｂꎬ凝胶过滤层析替代疏水层析ꎬ生物活性大大提高ꎮ本研究合成了编码ＩＦＮα２ｂ的基因ꎬ构建了表达载体ｐＢＶ２２０￣ＩＦＮα２ｂꎬ并在大肠杆菌ＤＨ５α内得到表达ꎮ同时建立了ｒｈＩＦＮα２ｂ大肠杆菌表达后的分离纯化工艺ꎮ发酵产物通过破菌㊁经过裂解㊁洗涤液去除杂质获得高纯度的包涵体ꎬ变㊁复性㊁ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析和凝胶过滤层析ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ￣１００进行纯化ꎬ得到ｒｈＩＦＮα２ｂ纯品ꎬ其比活可达１ˑ１０８ＩＵ/ｍｇꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀侯云德.干扰素及其临床应用[Ｍ].江苏:江苏科学技术出版社ꎬ１９８１ꎬ３.７１２梁果义ꎬ等:重组人干扰素α２ｂ的制备研究. All Rights Reserved.[２]㊀吴梧桐ꎬ丁锡申ꎬ刘晶晶.基因工程药物－基础与临床[Ｍ].北京:人民卫生出版社ꎬ１９９６.[３]㊀吴玉厚ꎬ吴冰洁ꎬ周国利ꎬ等.干扰素研究进展[Ｊ].生物学教学ꎬ２００７ꎬ３２(７):２－４.[４]㊀侯相山ꎬ王洪水.干扰素研究进展[Ｊ].安徽农业科学ꎬ２００７ꎬ３５(６):１７００－１７０２.[５]㊀何成ꎬ朱运松.干扰素的分子生物学研究进展[Ｊ].国外医学－微生物学手册ꎬ１９９４ꎬ１７(４):１４５－１４７ꎬ１５５. [６]㊀ＬｅｉｇｈＪＷꎬＰａｕｌＰＴꎬＭａｒｋＲＷꎬｅｔａｌ..Ｚｉｎｃｍｅｄｉａｔｅｄｄｉｍｅｒｏｆｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα２ｂｒｅｖｅａｌｅｄｂｙＸ￣ｒａｙｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙＲａ￣ｍａｓｗａｍｙ[Ｊ].Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ１９９６ꎬ４(１２):１１５３－１１６３. [７]㊀ＢｒｕｎｏＲꎬＳａｃｃｈｉＰꎬＣｉｍａＳꎬｅｔａｌ..Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｖｉｒａｌ.Ｈｅｐａｔ.ꎬ２０１２ꎬ１９(１):３３－３６.[８]㊀魏开坤ꎬ马学军ꎬ张丽兰ꎬ等.人α２ｂ型干扰素的基因合成㊁表达质粒构建及产物的制法[Ｐ].中国ꎬ９９１２５９６６.１ꎬ２００１.[９]㊀萨姆布鲁克Ｊꎬ拉塞尔ＤＷꎬ著ꎬ黄培堂ꎬ译.分子克隆实验指南(第三版)[Ｍ].北京:科学出版社ꎬ２００２ꎬ３９１－３９６. [１０]㊀汪家政ꎬ范明.蛋白质技术手册[Ｍ].北京:科学出版社ꎬ２０００ꎬ１１１－１１２.[１１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１０版(附录３４) [Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１０.[１２]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１０版(附录７１－７２)[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１０.[１３]㊀韩霭辰ꎬ王劲峰.疏水相互作用层析分离重组人干扰素ａ２ｂ[Ｊ].微生物学免疫学进展ꎬ２０１２ꎬ４０(６):８－１２.８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
干扰素α2b生产工艺的设计研究和行业分析范文
干扰素α2b生产工艺研究及行业分析姓名: 郭文文樊恒达学号: 24专业: 生命科学学院生物技术班级: 0803班·2011年5月干扰素α2b生产工艺研究及行业分析1 前言干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。
他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。
以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。
当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。
干扰素是一种细胞因子。
它是机体感染病毒时, 宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构相似、功能相近的低分子糖蛋白。
干扰素干扰病毒复制, 它是机体抗病毒感染的防御系统干扰素的种类很多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。
[1]目前所知道的人体干扰素按细胞结构和来源分α、β、γ干扰素三个型别, α干扰素又称人白细胞干扰素，它是由B淋巴细胞和单核细胞产生的,它可以分为23种亚型,分别称为干扰素α1、α2a、α2b、α3等，它们相互之间有较高的同源性。
[2]人β-干扰素是人纤维母细胞产生的, 只有一个亚型。
γ一干扰素又称免疫干扰素,它是由淋巴细胞的辅助诱导细胞产生的,与α、β干扰素之间没有明显的同源性。
三种干扰素都有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节活性。
干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。
干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。
抗病毒蛋白主要包括2′-5′A合成酶和蛋白激酶等。
前者降解病毒mRNA、后者抑制病毒多肽链的合成，使病毒复制终止。
近年来在国际上抗病毒和抗癌症的研究领域中,更多地在开发自然的免疫调节和抗病毒物质,干扰素作为一种天然的人体抗病毒蛋白质受到人们的关注。
人干扰素a2b组成成分
人干扰素a2b组成成分以人干扰素a2b组成成分为题，进行创作：我曾经是一名医学研究者，专注于探索人干扰素a2b的组成成分。
干扰素是一种重要的蛋白质分子，具有调节免疫系统和抗病毒作用的特性。
而干扰素a2b作为其中的一种亚型，对于抗病毒和抗肿瘤等疾病治疗具有重要的意义。
在我长时间的研究中，我发现人干扰素a2b主要由蛋白质组成，这些蛋白质经过复杂的生物合成过程才得以形成。
其中，包括多肽链和糖基等成分。
这些成分的组合和比例决定了干扰素a2b的生物活性和稳定性。
干扰素a2b的多肽链是由氨基酸残基组成的，其中包括丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸等多种氨基酸。
这些氨基酸通过特定的序列排列，形成了稳定的多肽链结构。
而糖基则是与多肽链结合的糖类分子，它们可以增强干扰素a2b的稳定性，并在体内发挥重要的生物学功能。
除了多肽链和糖基，干扰素a2b还可能含有其他辅助成分，如金属离子等。
这些辅助成分可以增强干扰素a2b的抗病毒和抗肿瘤活性，同时提高其生物利用率和药物稳定性。
通过深入研究和不断实验，我们逐渐揭示了人干扰素a2b的组成成分及其作用机制。
这些成果为进一步的临床应用和药物研发提供了重要的理论基础。
未来，我们将继续努力，深入探索干扰素a2b的组成成分，并进一步挖掘其在疾病治疗中的潜力。
人干扰素a2b的组成成分是由多肽链、糖基和辅助成分等组成的。
这些成分共同作用，赋予干扰素a2b抗病毒和抗肿瘤等重要生物学功能。
通过深入研究，我们可以更好地理解干扰素a2b的结构和功能，为其临床应用提供理论基础。
希望我的研究能够为人类的健康事业做出贡献，为世界带来更多的希望和可能。
干扰素的工艺制备流程
蛋白质含量测定
原理：利用蛋白质与特定试剂反应，生成有色物质，通过比色法测定蛋白质含量
试剂：考马斯亮蓝、溴酚蓝、福林酚试剂等
步骤：样品处理、试剂添加、反应时间、比色测定、结果计算 注意事项：样品处理要充分，试剂添加要准确，反应时间要控制好，比色测定要准确，结果计 算要正确。
基因序列分析
目的：检测干扰素 的基因序列
化学合成法
原料：氨基酸、核苷酸等
反应条件：温度、pH值、反应时间 等
合成步骤：氨基酸合成、核苷酸合成、 蛋白质合成等
产物纯化：色谱法、电泳法等 质量控制：检测纯度、活性等 包装与储存：无菌包装、低温储存等
干扰素质量检测
生物学活性检测
检测方法：采用细胞培养法或酶联免疫吸附法 检测指标：干扰素的生物学活性、纯度、稳定性等 检测步骤：样品制备、细胞培养、酶联免疫吸附、结果分析等 检测结果：根据检测结果判断干扰素的生物学活性是否达标
干扰素工艺制备流程
汇报人：
干扰素制备原料 干扰素制备工艺流程 干扰素质量检测 干扰素生产成本控制 干扰素工艺制备技术的发展趋势
干扰素制备原料
重组人干扰素
原料：人源细胞
制备方法：基因 工程
作用：抗病毒、 抗肿瘤
应用：临床治疗、 疫苗开发
病毒干扰素
病毒来源：自然界 中的病毒
病毒种类：包括流 感病毒、乙肝病毒 等
病毒提取：通过生 物技术从病毒中提 取干扰素
干扰素纯化：通过 生物技术对提取的 干扰素进行纯化处 理
干扰素制备工艺流程
基因工程法
基因工程法简介： 通过基因工程技术， 将干扰素基因导入 到微生物中，使其 表达出干扰素蛋白
基因工程法的优点： 可以大规模生产， 成本低，效率高
请设计干扰素a2b的发酵工艺规程
请设计干扰素a2b的发酵工艺规程1、对重组人干扰素a2b或该制剂的任何成份有过敏史者禁用。
2、患有严重心脏疾病者禁用。
3、严重的肝、肾或骨髓功能不正常者禁用。
4、癫痫及中枢神经系统功能损伤者禁用。
5、有其他严重疾病不能耐受本品者，不宜使用。
[成份]主要成份为重组人干扰素a2b，由高效表达人干扰素a2b。
基因的腐生型假单胞菌，经发酵、分离和高度纯化制成。
辅料为人血白蛋白，甘露醇、磷酸氢二钠、酸二氢钠。
[性状] 应为白色薄壳状琉松体，加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
[适应症]1、用于治疗某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣。
2、用于治疗某些肿瘤，如毛细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴痛、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、喉乳头状瘤、卡波氏肉瘤、卵巢癌、基底细胞癌、表面膀胱癌等。
[规格]按不同规格分别为1X106IU,支，3X106IU/支，5X106IU/支，6X106IU/支，复溶后体积1、0毫升。
[用法用量]本品可以肌肉注射、皮下注射和病灶注射。
1、慢性乙型肝炎: 皮下或肌肉注射，3--6x106IU/日,连用四周后改为3次/周，连用16周以上。
2、急慢性丙型肝炎:皮下或肌肉注射,3--6x106IU/日,连用四周后改为3次/周，连用16周以上。
3、丁型肝炎: 皮下或肌肉注射，4-5x106TU/日,连用四周后改为3次/周，连用16周以上。
4、带状疱疹: 肌肉注射，1x1061U/日，连用6天，同时口服无环鸟苷。
5、尖锐湿疣: 可单独应用，肌肉注射，1-3x1061U/日，连用四周。
也可与激光或电灼等合用，一般采用疣体基底部注射，1x1061U/次。
6、毛细胞性白血病: 2-8x 1061U/m2天，连用至少3个月、7、慢性髓细胞性白血病: 3-5x1061Um2天，肌肉注射。
可与化疗药物羟基脲、Ara-c等合用。
8、多发性骨髓瘤:作为诱导或维持治疗，3-5x1061U/m2,肌肉注射，3次/周，并与VMCP等化疗方案合用。
注射用重组人干扰素a-2b工艺规程
技术标准文件1．产品概述1.1 产品名称：商品名：隆化诺通用名：注射用重组干扰素α-2b英文名：Recombinant Human Interferon α-2b for Injection。
汉语拼音：Zhusheyong Chongzurenganraosu α-2b。
产品代码:1.3类别：生物药1.4剂型：冻干粉针剂1.5规格：⑴100万单位；⑵300万单位；〔3〕500万单位1.6批量：60000 瓶1.7性状：本品为白色薄壳状疏松体，参加标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
1.8作用与用途：治疗慢性乙型肝炎、肿瘤及其它病毒性疾病。
1.9包装规格：100万单位×10瓶×40盒/箱， 300万单位×10瓶×40盒/箱，500万单位×10瓶×40盒/箱1.10贮藏：2～8℃避光保存。
1有效期：2年6个月2批准文号：300万单位国药准字S1*******；500万单位国药准字S2*******；3考前须知：1. 本品冻干制剂为白色疏松体，溶解后为无色透明液体，如遇有浑浊、沉淀等异常现象，那么不得使用。
包装瓶有损坏、过期失效不能使用。
1.13.2. 以注射用水溶解时应沿瓶壁注入，以免产生气泡，溶解后宜于当日用完，不得放置保存。
1.14禁忌：1.14.1. 对重组人干扰素α-2b或该制剂的任何成分有过敏史。
1.14.2. 患有严重心脏疾病。
1.14.3. 严重的肝、肾或骨髓功能不正常者。
1.14.4. 癫痫及中枢神经系统功能损伤者。
1.14.5. 有其他严重疾病不能耐受本品者，不宜使用。
2．处方及处方依据：规格：100万单位/瓶；批量：60000 瓶规格： 300万单位/瓶；批量：60000 瓶规格： 500万单位/瓶；批量：60000 瓶2.2处方依据：规格： 100万IU /瓶国药准字S1*******；规格： 300万IU /瓶国药准字S1*******规格： 500万IU /瓶国药准字S2******* 2.3生产批件:药品GMP证书及生产批件复印件：见附录3．工艺3.2 生产过程及技术参数配料仓库配料人员应认真对照生产领料单〔附件1〕核对原料“合格证〞上的代号、名称、规格、有效期，按生产领料单上物料品名及数量仔细称量，在生产核料单〔附件2〕和配料标签上注明物料的物料编码、名称、批号、重量，由QA中控人员监督复核生产核料单、重量、配料标签与封签，内容无误后，由配料人和复核人共同在生产领料单和核料单签字。
干扰素的工艺制备流程
干扰素的工艺制备流程干扰素是一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能。
干扰素的制备是通过基因工程技术来实现的，下面将介绍干扰素的工艺制备流程。
1. 基因克隆在干扰素的工艺制备中，首先需要进行基因克隆。
这一步是将目标基因与表达载体连接起来，形成重组 DNA 分子。
常用的表达载体包括质粒和病毒载体。
基因克隆的具体步骤如下：1.1 选择目标基因：根据所需要制备的干扰素类型，选择相应的目标基因序列。
1.2 购买引物：根据目标基因设计引物，并购买合成。
1.3 PCR 扩增：使用引物进行 PCR 扩增，得到目标基因的 PCR 产物。
1.4 酶切与连接：将目标基因的 PCR 产物切割与载体进行连接，形成重组 DNA 分子。
常用的酶切酶有 EcoRI、BamHI、XhoI 等。
1.5 转化：将重组 DNA 转化至宿主菌中，如大肠杆菌，以便后续大规模培养。
2. 克隆表达在克隆表达阶段，需要将重组 DNA 导入到宿主细胞中，并使其表达干扰素。
克隆表达的具体步骤如下：2.1 酵母菌检测: 通过将宿主细胞转化至酵母菌中，进行孢子碟试验来筛选高表达的菌株。
2.2 培养: 选取高表达的菌株进行大规模培养，提供充足的菌体用于干扰素的表达。
2.3 诱导表达: 通过添加合适的诱导剂，如等温诱导或化学诱导，使菌体产生干扰素。
2.4 培养时间控制: 根据不同的干扰素类型，确定合适的培养时间。
2.5 菌体破碎: 将培养得到的菌体进行破碎，以释放干扰素。
2.6 干扰素纯化: 利用分离纯化技术，如柱层析、高效液相层析等，对菌体提取液进行纯化，得到纯净的干扰素。
3. 干扰素的活性检测制备干扰素后，需要对其进行活性检测，以确保其具有预期的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等功能。
干扰素活性检测的方法有多种，包括：3.1 细胞抑制实验：通过对目标细胞进行处理，并观察细胞生长情况，来判断干扰素抑制细胞生长的能力。
3.2 抗病毒实验：通过对目标病毒感染细胞进行处理，并观察细胞感染情况，来判断干扰素抗病毒能力。
干扰素生产工艺PPT课件
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（4）初级分离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过 夜。
离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
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4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装
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干扰素生产工艺路线（2）
人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。 缺点： 活性低，退出临床应用。
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干扰素生产工艺路线（3）
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞 的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择 性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强 500～1000倍。另外，Ⅱ型干扰素也可通过增 强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其 抗肿瘤效应。
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免疫调节活性机制
免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和 NK细胞等均有一定作用。
制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成 cDNA,PCR，
基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。
人干扰素a2b生产工艺
测定方法
菌体浓度测定采用浊度法 测定波长600 nm处的光密度(OD600), 根据标准曲线计算菌体干重。 葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒测定 乙酸测定采用气相色谱法
hIFNa2b的电泳测定采用三(羟甲 基)甲基甘氨酸(φ=0.15)-SDS-聚丙 烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白 , 凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分
析系统定量 。
取发酵液于12 000 r/min,4°C下离 心10 min,得到的菌体用Tris-HCl缓 冲液(50 mmol/L, pH 7.0,4°C)洗涤, 然后溶于上样缓冲液中[12mmol/L、 pH 6.8 Tris-HCl,甘油 (φ=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇 (φ=0.02),溴酚兰(0.5 g/L]。
结果与讨论
分批发酵
在5 L罐中分批培养
葡萄糖流加对于hIFNa2b 生产水平的影响
诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平 的影响
Interferona2b,hIFNa2b)
hIFNa2b是由165个氨基酸组成的多 肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、 修复DNA结构损伤等作用。
hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、
呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等 均具有治疗作用。
培养基： 种子培养基为LB培养基 蛋白胨10 g/L 酵母抽提物5 g/L NaCl 10 g/L 灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠 分批发酵培养基为含葡萄糖 5 g/L的LB 培养基
发酵罐培养
将二级种子以6%的接种量接入5 L 发酵罐(RIBE-5型)中。培养液装量 为2.5 L，生长阶段控制温度30°C, 表达阶段控制温度42°C，发酵过 程中控制pH为7.0,通气量4 L/min， 初始搅拌转速为400 r/min,发酵过 程中转速逐渐提高以维持溶氧大于 20%。
干扰素生产工艺
干扰素生产工艺干扰素是一种重要的抗病毒蛋白质，广泛应用于临床医学中治疗病毒感染和恶性肿瘤。
干扰素的生产工艺包括基因工程和发酵工艺两个部分。
基因工程是干扰素生产的关键步骤之一。
首先，从人体或其他动物中提取相关基因，然后将其插入到融合质粒或细胞株中。
目前常用的融合质粒是质粒pBR322，细胞株则多选用大肠杆菌(E.coli)。
将外源基因与质粒或细胞株插入时，需要加入特定的限制性内切酶进行剪切，以保证外源基因能够正确插入。
接下来，利用转化法将融合质粒或细胞株引入宿主细胞中，形成重组细胞。
重组细胞经过筛选和分离，最终能够获得具有干扰素基因的细胞株。
发酵工艺是干扰素生产的另一个重要环节。
发酵是利用微生物在合适的培养基中进行代谢活动，生产目标产物。
干扰素的生产主要利用大肠杆菌进行发酵。
首先，将重组细胞培养在含有理想培养基的发酵罐中。
理想的培养基是指含有合适的碳源、氮源、矿物质和辅助因子的培养基，能够提供微生物生长所需的养分。
培养基的pH值、温度和搅拌速度等条件也需要适当控制，以保证微生物能够有效地生长和产生干扰素。
在发酵过程中，需要定期对发酵罐中的微生物进行监测和控制。
通过检测微生物的生长情况、溶氧和酸碱度等参数，可以调整培养条件，以提高干扰素的产量和纯度。
此外，还需要对干扰素进行纯化和浓缩处理。
一般采用柱层析和超滤等技术，将发酵液中的干扰素与其他杂质物进行分离和去除，最终得到较纯的干扰素溶液。
总之，干扰素的生产工艺主要包括基因工程和发酵工艺两个部分。
基因工程通过插入外源基因将干扰素基因引入宿主细胞中，形成重组细胞。
发酵工艺则利用重组细胞在合适的培养基中进行发酵，通过监测和控制微生物的生长条件，最终得到较纯的干扰素产物。
随着生物技术的不断发展，干扰素的生产工艺也在不断优化，以提高产量和纯度，满足临床应用的需求。
重组人干扰素a2b栓剂及其制备方法[发明专利]
![重组人干扰素a2b栓剂及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f3b3edd643323968001c9228.png)
专利名称：重组人干扰素a2b栓剂及其制备方法专利类型：发明专利
发明人：宋礼华,王荣海,倪晓燕,储成风
申请号：CN200910144396.6
申请日：20090806
公开号：CN101612114A
公开日：
20091230
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种重组人干扰素a2b栓剂及其制备方法。
本发明的重组人干扰素a2b栓剂的具体组成如下：重组人干扰素a2b 1mg(1.0×10IU)；型号为1000的聚乙二醇1000克；型号为600的聚乙二醇660克；无血清物质0.3g－6g；其中的无血清物质为药用明胶。
本发明栓剂的制备方法包括以下步骤：先是重组人干扰素a2b经药用明胶的处理，其次是聚乙二醇的加热灭菌处理，再将处理好的重组人干扰素a2b和聚乙二醇溶液混合搅匀，再经灌注冷却成型即可制成成品。
采用药用明胶作为保护剂，具有来源广泛、价格便宜、生产成本低、无毒无害、保护效果明显，且本发明的制备方法操作简单方便。
申请人：安徽安科生物工程(集团)股份有限公司
地址：230088 安徽省合肥市高新区海关路9号
国籍：CN
代理机构：合肥诚兴知识产权代理有限公司
代理人：汤茂盛
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析系统定量 。
取发酵液于12 000 r/min,4°C下离 心10 min,得到的菌体用Tris-HCl缓 冲液(50 mmol/L, pH 7.0,4°C)洗涤, 然后溶于上样缓冲液中[12mmol/L、 pH 6.8 Tris-HCl,甘油 (φ=0.05),SDS(7.5 g/L),巯基乙醇 (φ=0.02),溴酚兰(0.5 g/L]。
结果与讨论
分批发酵
在5 L罐中分批培养
葡萄糖流加对于hIFNa2b 生产水平的影响
诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平 的影响
Interferona2b,hIFNa2b)
hIFNa2b是由165个氨基酸组成的多 肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、 修复DNA结构损伤等作用。
hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、
呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等 均具有治疗作用。
培养基： 种子培养基为LB培养基 蛋白胨10 g/L 酵母抽提物5 g/L NaCl 10 g/L 灭菌后加入100 mg/L氨苄青霉素钠 分批发酵培养基为含葡萄糖 5 g/L的LB 培养基
发酵罐培养
将二级种子以6%的接种量接入5 L 发酵罐(RIBE-5型)中。培养液装量 为2.5 L，生长阶段控制温度30°C, 表达阶段控制温度42°C，发酵过 程中控制pH为7.0,通气量4 L/min， 初始搅拌转速为400 r/min,发酵过 程中转速逐渐提高以维持溶氧大于 20%。
补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽 后采用3种不同的葡萄糖流加方式，即 恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率 流加。 恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入 葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(L· h)的速率 流加葡萄糖；恒比供应速率(QG)为 0.27 g/(g· h)，每小时根据菌体浓度调 整葡萄糖的流加速率。
基因工程菌 生产人干扰素
基因工程菌： 将目的基因导入细菌体内使其表达， 产生所需要的蛋白的细菌称为基因工 程菌，如：大肠杆菌。
菌株 ：宿主菌E. coli BL21(DE3) 重组质粒为pBAI 带有氨苄青霉素耐药性标记 hIFNa2b基因表达受λPL启动子 和质粒cI857编码的蛋白调控
目标产物：人干扰素a2b (Human
未特别注明的补料分批发酵培养基 葡萄糖 5 g/L的2×LB培养基 蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L 补料液为400 g/L的葡萄糖 培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均 为Oxoid产品,其余试剂为国产分析纯, 采用去离子水配制。
培养方法
种子培养
从-20°C保藏的甘油管中取出1ml菌 液,接入装有30 ml种子培养基的 250mL锥形瓶,于摇床200 r/min,30°C下培养10 h,为一级种子; 将一级种子以1.5%的接种量转接至装 有70 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中, 相同条件培养9 h,为二级种子。
3 0.5 ×பைடு நூலகம்0
测定方法
菌体浓度测定采用浊度法 测定波长600 nm处的光密度(OD600), 根据标准曲线计算菌体干重。 葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒测定 乙酸测定采用气相色谱法
hIFNa2b的电泳测定采用三(羟甲 基)甲基甘氨酸(φ=0.15)-SDS-聚丙 烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白 , 凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分