受体植物离体培养再生系统的建立

高频再生系统的建立
外植体的选择
• 外植体生理年龄 • 外植体细胞生理状态 • 外植体的遗传背景 • 外植体的选择与受体 系统相匹配
培养基选择Biblioteka Baidu
• 植物的营养特性 • 激素的选择
目前国际上流行的培养基及特点
MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而 设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡 溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和 生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用 于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。 有些培养基是由它演变而来的。 B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。 其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长 有抑制作用。从实践得知有些植物在B5 培养基上生长更适 宜，如双子叶植物特别是木本植物。
利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细
胞或愈伤组织，建立单倍体的基因转化受体系统； 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。
特点
• 具有更强的接受外源DNA的潜能； • 转化的基因无显隐性的影响，利于性状的选育，加 倍后可迅速获得纯合二倍体新品种； • 花粉管通道法将现代的分子育种与常规育种紧密结 合，是十分有潜力的受体系统； • 在花粉或小孢子培养技术成熟的植物种类中，利用 花粉或小孢子培养系统作为受体系统更为理想。
细胞系及其体细胞胚受体系统
• 通过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系，通常具 有较好的遗传和生理状态的一致性，通过一定的培养基 调节，可使细胞进入胚性状态进而形成体细胞胚。 • 该系统培养技术比原生质体容易，转化效率又优于其他 组织培养系统，因此被认为是最理想的基因转化受体系 统。
特点：
胚性细胞繁殖量大，同步性好，是理想的基因转化
White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。
1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4 的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生 根培养。 N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养 而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含 量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培 养和其他组织培养。 KM—8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其 特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广 泛用于原生质融合的培养。
转化的外植体一般采用种子，无菌实生苗的胚轴、子
叶或幼叶，可进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试
管苗，以及可较高频率诱导的营养变态器官等。
四、抗生素敏感性
• 植物基因转化中，通常使用两类抗生素： 抑菌抗生素 选择性抗生素 选择性抗生素应满足以下条件： 植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感
植物基因转化受体系统的条件
• 高效稳定的再生能力
• 较高的遗传稳定性
• 具有稳定的外植体来源
• 抗生素敏感性 • 农杆菌敏感性
一、高效稳定的再生能力
用于植物基因转化的外植体： 必须易于再生；
有很高的再生频率；
并且具有良好的实验稳定性和重复性。
不同植物的种类、细胞类型、细胞状态、特定的植物
培养技术的成熟程度等在建立受体系统时均需考虑。
高频再生系统的建立
抗生素的敏感性试验 对农杆菌介导的 基因转化系统而 言
农杆菌敏感性试验
一、 高频再生系统的建立
高频再生系统必须满足4个条件： • 外植体的组织细胞具有诱导愈伤组织和再生完整 植株的能力，并且最好是外植体能直接分化出芽 • 芽的分化率要高； • 易于离体培养，具有高度可重复性； • 体细胞无性系变异小。
抗生素敏感性测定
设计出愈伤组织诱导或分化再生培养基，高压 灭菌后加入不同种类、不同浓度梯度的无菌抗生 素；再将未经转化的受体材料至于选择培养基上
培养，观察该抗生素对其分化再生的影响，以及
未附加抗生素的培养基接种同样的受体材料未对
照来确定适宜的抗生素及浓度。
农杆菌的敏感性试验及菌种的选择
农杆菌载体转化是目前植物最成功的转化系统。一般在 进行转化前，首先需要进行菌株的接瘤或发根试验，选择侵 染敏感的农杆菌种类。 农杆菌敏感性试验的原理是利用野生型农杆菌能在外植体 组织中形成肿瘤或发根，根据肿瘤的诱导率、发生时间及生 长状态的敏感程度。其操作程序是把常用的菌株接种在固体 琼脂平板或液体培养基中，用牙签挑取菌体，穿刺受体植物 组织。可在同一植株的不同部位——叶片及其中脉、花、茎 和幼茎的节间多次接种，比较其敏感性。然后将植株在光下 几周后观察肿瘤或发根的诱发情况，能形成肿瘤或发根，则 说明该植物材料可作为农杆菌的一个宿主，可用农杆菌介导 转化。
受体系统常见的问题及其解决途径
• 再生能力及其遗传稳定性
• 褐化
• 玻璃化
再生能力及其遗传稳定性
• 再生能力下降的解决途径：
减少筛选继代次数；
选用合适的外植体，采用最适培养基。
• 减少变异性的措施：
减少组织培养时间，甚至完全取消组织培养过程。
比如用基因枪轰击胚轴或芽的分生组织，收获种
转化方法。 • 原生质体再生系统易于在相对均匀和稳定同等条件下 进行准确的转化和鉴定。 • 通过原生质体培养，细胞分裂形成基因型一致的细胞 克隆，因此再生植株的嵌合体少。 • 原生质体培养周期长，培养技术限制该系统的应用。
特点
• 原生质体受体系统利于准确的转化和鉴定； • 转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少； • 但由于目前许多植物的原生质培养体系还不成熟， 受原生质体培养技术的限制，转化试验的重复性较 差； • 原生质体培养周期长，受体细胞本身的体细胞变异 频率高，遗传稳定性差。
感受态细胞，转化效率高； 转化获得的转基因植株嵌合体少； 体细胞胚具有两极性，减少了不定芽发育途径中的 生根培养过程；
获得的后代个体间遗传背景一致，无性系变异小。
生殖细胞受体系统
• 生殖细胞受体系统指的是以生殖细胞如花粉粒和卵细 胞为受体细胞进行基因转化的系统，也叫种质系统。 • 两条途径：
特点
• • • • 外植体来源广泛； 扩繁量大，可获得较多的转化植株； 适用的植物范围广； 从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特点，形 成嵌合体较多（一种含有两种以上基因型组织的机体，可能是
基因突变、染色体异常分离或移植的结果 ）；
• 再生植物无性系变异较大，转化的外源基因遗传 稳定性较差。
注意问题
• 直接使用外植体组织进行农杆菌侵染时，应 注意从活跃生长的植物部位取材； • 用愈伤组织进行转化，应在愈伤组织细胞处 于分生细胞状态时进行转化，此时易于接受外源 基因，转化效率高； • 愈伤组织必须保持良好的生长状态，继代周期 不能太长。
不经过愈伤组织的受体系统
• 不经过愈伤组织的受体系统也称直接分化再生系统，
性；
抗生素对受体植物没有剧烈的毒性。
五、农杆菌敏感性
• 农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率高、多为单拷 贝插入等优点，是常用的植物基因转化方法
• 对于利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体所介导的植物基因转
化而言，需要植物受体材料对农杆菌敏感,即受体应是 农杆菌的天然宿主，这样才能更容易接受外源基因。 • 选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌侵 染的敏感性，敏感的才能作为受体系统。
培养所需环境条件
光照强度：一般而言，愈伤组织的形成并不需要光照； 培养前期1000-4000lx，后期10000 lx。 光照时数：不同培养的组织其光照时间不同，如烟草愈伤 组织采用1000 lx 16小时/日培养； 光 而花椰菜组织培养则以4000 lx 9小时/日光照为宜 光质：一般采用日光灯作为光源。组织培养中关键的器 官形成作用，是种光形态发生现象，是受光敏色素 控制的。
受体植物离体培养再生体系的建立
植物基因转化受体系统

植物基因转化受体系统的条件
植物基因转化受体系统的类型及特性


植物基因转化受体系统的建立
植物基因转化受体系统常见的问题及其解 决途径
植物基因转化受体系统
植物基因转化受体（gene transformation receptor）系统——一般是指用于转化的外植体 通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高 效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因 （foreign gene)的整合（recombination），对用 于转化选择的抗生素敏感的再生系统。
是指外植体细胞越过脱分化阶段，直接分化出不定芽， 从而获得再生植株的受体系统。 研究显示，采用叶片、幼茎、子叶、胚轴以及一些 营养变态器官为外植体时，在适宜的培养技术控制下，
均可直接分化出芽。
特点
• 获得再生植株周期短，操作简单； • 体细胞无性系变异相对较小，可较好的维持受体植 株的遗传特性； • 转化的外源基因能稳定遗传（特别是茎尖）； • 同样可能出现较多的嵌合体； • 外植体直接分化出芽较难，转化细胞直接分化成植 株难度更大。
注意问题
• 直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物 • 选材：从组织类型上讲，子叶、叶片、胚轴 和某些营养变态器官通常比较容易诱导；从 细胞状态上讲，薄壁细胞状态外植体较容易 诱导。
原生质体再生系统
• 原生质体是“裸露”的植物细胞，能直接高效地摄取
外源基因，因而转化效率高且合适于现在建立的所有
根瘤农杆菌 及其诱导产生的冠瘿瘤
植物基因转化受体系统的类型及特性
• 经过愈伤组织的受体系统
• 不经过愈伤组织的受体系统
• 原生质体再生系统
• 细胞系及其体细胞胚受体系统
• 生殖细胞受体系统
经过愈伤组织的受体系统
• 经过愈伤组织的受体系统是指经过愈伤组织的受体系 统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，转化，并通过 分化培养获得再生植株的受体系统。 包括： • 外植体先诱导形成愈伤组织，再利用愈伤组织转化外源基 因，进而再生植株 • 利用农杆菌直接侵染外植体，经过培养形成愈伤组织，再 分化成植株
二、较高的遗传稳定性
通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持物种原
有性状不变的基础上增加某一（些）性状或对某一特定 性状进行改良，因此，植物受体系统接受外源DNA后不 影响其自身的遗传体系，同时又能稳定地将外源基因遗 传给后代，保持遗传的稳定性十分重要。
三、具有稳定的外植体来源
基因转化的频率较低，需要多次反复的实验，所 以就需要大量的外植体材料。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研究的进行， 并从材料的源头上提高实验结果的重现性，便于对实验 结果的总结。
第三节 植物基因转化受体系统的建立
• 建立一个好的受体系统是实现基因转化的先 决条件。 • 受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技 术，而且要求比一般的组织培养技术要高。
植物基因转化受体系统的建立
外植体具有诱导 callus和再生植株 的能力；芽的分 化率高；易培养 ；体细胞无性系 变异小。 外植体的选择制备
激素
细胞分裂素
促进细胞分裂和分化不定芽 6-BA、KT、ZA、2iP
赤霉素（GA）
抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GA3
生长素 诱导细胞的分裂和根的分化。IBA（吲哚丁 酸）、IAA（吲哚乙酸）、NAA、2,4-D、诱 导生根，2,4-D诱导愈伤组织
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是 愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分 化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基 中生长素与细胞分裂素的比例。 高 有利于根的形成和愈伤组织的形成; 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化; 低 有利于芽的形成; 生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在 组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部 位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使 用为0.05-5mg／L，细胞分裂素0.05—10mg／L。
温度：一般习惯将培养物置于恒温下，通常应用的温度为
25OC 左右。
二、抗生素敏感性
受体系统建立时，需要对相关的抗生素种类及其浓 度进行试验筛选（抗生素敏感性试验） 抑制农杆菌生长的抗生素种类和浓度的筛选要考虑 植物种类和农杆菌株系两个方面 • 对植物细胞无毒，不显著抑制植物细胞生长 • 浓度以能够抑制农杆菌生长而不妨碍植物生长的浓 度为宜 用于转化子筛选的抗生素浓度的确定