补充2酶催化活性的测定方法
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理
酶活性测定的原理是通过测量酶催化下特定底物转化为产物的速率来反映酶的活性水平。
主要有以下几种常用方法：
1. 光度法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生有色产物或吸收物质，通过测量产物的吸光度变化来间接评估酶活性。
例如，过氧化物酶活性的测定可以使用过氧化氢和染色剂底物，通过测量产物有色化合物的吸光度变化来评估。
2. 放射性同位素法：将底物标记上放射性同位素，通过测量酶催化下放射性同位素的放射活性来确定酶活性。
例如，通过添加放射性标记的底物[^3H]葡萄糖，测量酶催化下的葡萄糖转化为[^3H]二氧化碳的速率来评估葡萄糖酶活性。
3. 荧光法：利用酶催化下底物与某些荧光试剂反应产生荧光物质，通过测量产物的荧光强度变化来评估酶活性。
例如，酸性磷酸酶活性的测定可以使用荧光底物4-甲基硝基苯磷酸，通过测量产生的荧光信号来评估酶活性。
4. 比色法：利用酶催化下底物与某些试剂反应产生可测定的颜色变化，通过测量产物的颜色强度来评估酶活性。
例如，硫酸酯酶活性的测定可以使用对硫酸酯类底物水解产生的有色产物对硝基酚，通过测量颜色强度来评价酶活性。
这些方法均基于酶催化下底物转化为产物的反应，并结合了不同的测定原理和技术手段来获取酶活性的定量数据。
酶活力测定方法
NH
NH-CO-
H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5
253nm处的A随酶促反应递增，根 据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化 学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力 越高。
酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应 进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速 度的测定，求得酶的浓度或含量。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
酶工程第1章酶活性单位及其测定方法
1 分光光度法
（spectrophotometry）
硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加
入的显色剂对－氨基苯磺酸和α －萘胺反应生成玫 瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物 的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶， NAD+ 或NADP + 在340nm处光吸收很少，而其还原
1000 0.3 15 μmol/min/mg protein 20
U/mg protein
二、酶活性测定的主要方法
温度、pH、离子强度（I=(1/2)Σ CZ 2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分
离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或
沉淀，就易于分离。
5 电化学方法
（electrochemistry）
① pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生H＋ 或减少H＋的反应来说，用1/1000 pH单位精度的pH 计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入 酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 ② 电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物 和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微 电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变 化。 ③ 电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流 变化。
1 katal＝6×107 IU
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
实验二酶活力测定方法的研究
实验二酶活力测定方法以及水溶性蛋白含量的测定一．研究背景及目的酶是催化生物体内生化反应的重要成分，它可以在常温常压下非常高效的催化化学反应。
对于酶，我们最关注的的就是它的活性。
在实验中，当我们做酶实验时，只有知道自己在做的酶是有活性的，我们后续的工作才有可能继续。
在实验室购买特定的酶时，我们关注的不是购买的重量，而是购买到的酶活性有多少，能催化多少摩尔的化学反应。
掌握酶催化的活性也有利于我们估计反应需要进行的时间。
甚至在我们改造酶结构的时候，也许要一个标准证明我们的改造是有效的。
这一切，都需要我们能够测定酶的活性。
本实验的目的就是设计实验，合理的测定酶活力。
体会在不同的酶中，具体的实验设计步骤是否相同；学会根据不同酶的特点，设计其酶活力的测定方法；探究酶活力测定的基本原则。
二．原理淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。
禾谷类种子的萌发时可快速将淀粉转变成葡萄糖，由此我们推断禾谷类种子中存在不止一种淀粉酶，一种是我们熟知的β-淀粉酶，它可从淀粉还原性末端切掉葡萄糖。
另一种α-淀粉酶它既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α-1，4-链。
休眠的种子中就只有β-淀粉酶的存在，α-淀粉酶是在和粽子萌发的过程中形成的。
α-淀粉酶和β-淀粉酶各有其一定的特性。
β-淀粉酶不耐热，在高温下容易发生钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH 3.6以下时发生钝化。
在萌发的种子中，这两种淀粉酶同时存在。
想要测定其中一种酶的活性，就要设法钝化另一种酶。
该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。
通过3,5－二硝基水杨酸比色法确定催化产麦芽糖的含量。
三．仪器与试剂1.仪器：低速离心机（飞鸽牌，TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）722分光光度计（上海分析仪器总厂）；40℃水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司）；70℃水浴锅（电热恒温水浴锅，天津市中环实验电炉有限公司）；药物天平（HCTP12B1，北京宣武天平厂制）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;研钵；50ml容量瓶；100ml容量瓶。
化学技术中催化剂活性的定量测试方法
化学技术中催化剂活性的定量测试方法化学技术发展至今，催化剂在各个领域中扮演着重要角色。
催化剂的活性是评价其性能和效果的重要指标之一，因此如何准确地测试催化剂的活性，一直是化学研究领域的热门话题。
本文将介绍一些常见的化学技术中催化剂活性的定量测试方法，希望能为读者提供一些参考。
一、化学反应速率法化学反应速率法是一种常见的测试催化剂活性的方法。
该方法通过测量反应物消失速率或生成物的增加速率来确定催化剂的活性。
在进行测试时，需要根据具体反应的特点选择合适的反应物和测量方法。
例如，在催化剂活性测试中，常用的方法有活性炭吸附甲烷气相催化裂化反应和铂催化醇氧化反应等。
二、吸附测定法催化剂表面的吸附性质与其活性密切相关。
吸附测定法是一种有效的测试催化剂活性的方法之一。
该方法利用催化剂表面对特定物质的吸附特性进行测量，来评估催化剂的活性。
例如，可以使用吸附测定法测试催化剂在吸附甲醇或二氧化碳等反应物时的吸附性能，进一步推测其活性。
三、扩散测定法催化剂活性还与扩散性能密切相关。
扩散测定法是一种常用的测量催化剂活性的方法。
通过对催化剂表面上的反应物或产物浓度分布进行测量，来推断催化剂对反应物的吸附和扩散性能，进而评估催化剂的活性。
例如，可以利用催化剂表面上溶解度测定法测量溶解在催化剂表面的反应物浓度，来推测催化剂的活性。
四、电化学测定法电化学测定法是一种常见的测试催化剂活性的方法。
该方法是利用外加电场来推动催化剂上的电子转移反应，进而测量催化剂的活性。
电化学测定法的优点是可以在原位条件下测试催化剂的活性，具有较高的灵敏度和准确性。
例如，可以利用循环伏安法测量催化剂在不同电位下对特定物质的电流响应，进一步推断其活性。
五、光谱测定法光谱测定法是一种常用的测试催化剂活性的方法。
该方法是通过测量催化剂对特定波长光的吸收或散射特性，来评估催化剂的活性。
光谱测定法具有非破坏性、无特殊样品处理的优点，能够在实际工作条件下测试催化剂的活性。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活性测定的数据计算公式
酶活性测定的数据计算公式酶活性测定是生物化学实验中常用的一种方法，用来测量酶在特定条件下的活性水平。
酶活性的测定对于研究酶的功能和特性，以及对酶的应用具有重要意义。
在进行酶活性测定时，需要根据实验数据计算酶活性的值，这就需要用到酶活性测定的数据计算公式。
酶活性测定的数据计算公式是根据酶活性的定义和测定方法来推导的。
酶活性通常是以单位时间内酶催化反应所产生的产物的量来表示的，常用的单位包括国际单位（U）和摩尔/分钟（mol/min）。
在测定酶活性时，通常需要测量酶催化反应产生的产物的量，然后根据测量数据计算酶活性的值。
酶活性测定的数据计算公式通常包括以下几个参数，反应产物的浓度、反应时间、反应体积、酶的载体蛋白量等。
根据不同的酶活性测定方法，这些参数可能会有所不同。
下面我们将介绍几种常用的酶活性测定方法及其相应的数据计算公式。
一、比色法测定酶活性。
比色法是一种常用的酶活性测定方法，通过测量酶催化反应产生的产物的吸光度来确定酶活性。
在比色法测定酶活性时，通常需要测量反应产物的吸光度，并根据吸光度的变化来计算酶活性的值。
比色法测定酶活性的数据计算公式如下：酶活性（U）=（ΔA/min）/ε×V。
其中，ΔA为单位时间内吸光度的变化量，ε为产物的摩尔吸光系数，V为反应体积。
通过测量单位时间内吸光度的变化量，然后根据吸光度的变化量、摩尔吸光系数和反应体积来计算酶活性的值。
二、酶标记法测定酶活性。
酶标记法是一种通过标记酶的载体蛋白来测定酶活性的方法，通过测量标记物的放射性或荧光强度来确定酶活性。
在酶标记法测定酶活性时，通常需要测量标记物的放射性强度或荧光强度，并根据强度的变化来计算酶活性的值。
酶标记法测定酶活性的数据计算公式如下：酶活性（U）=（ΔC/min）/ε×V。
其中，ΔC为单位时间内标记物的强度变化量，ε为标记物的摩尔放射性或荧光强度系数，V为反应体积。
通过测量单位时间内标记物的强度变化量，然后根据强度的变化量、摩尔放射性或荧光强度系数和反应体积来计算酶活性的值。
检测酶的活性的方法
检测酶的活性的方法酶活性是指酶分子在特定条件下催化底物转化的速率。
酶活性的研究对于深入理解生化过程、疾病发生机制以及药物开发具有重要意义。
本文将介绍酶活性检测的一些常用方法。
1. p-Nitrophenyl Phosphate（pNPP）法：pNPP法是一种常用的颜色反应法，适用于检测酸性和碱性磷酸酶以及碱性酮糖酸酶的活性。
该方法的原理是将酶催化底物pNPP水解为p-nitrophenol（黄色）和磷酸，利用p-nitrophenol的比色特性（pH 10时吸光度λ=405 nm），通过检测吸光度的变化来间接测定酶活性。
2. 毛细管电泳法：毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis, CE）是利用酶对底物的催化作用导致电泳迁移率发生变化的原理来检测酶活性。
该方法具有高灵敏度、高分辨率、快速分析等优点。
一般通过分离、富集和检测等步骤来实现。
3. 酶标记法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）：ELISA是一种常用的酶标记技术，适用于定量检测酶活性。
该方法的原理是利用酶标记的抗体与底物结合后，通过酶对底物的催化作用产生信号。
常用的酶标记有辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶等。
4. 荧光检测法：荧光检测法是利用酶对底物的催化作用改变溶液中荧光分子的性质来实现酶活性的检测。
其中，常用的荧光标记物有荧光素（Fluorescein）、羧酮荧光素（Tetramethylrhodamine, TAMRA）等。
通过测量荧光的强度和寿命来反映酶活性。
5. 放射性同位素法：放射性同位素法是一种高灵敏度的检测方法，利用酶对标记同位素底物的催化作用来测定酶活性。
常用的标记同位素有^14C、^32P、^3H等。
通过测定样品中放射性荧光的强度来反映酶活性。
以上仅介绍了一小部分常用的酶活性检测方法，每种方法都有其特点和适用范围。
酶活测定的原理
酶活测定的原理酶活测定是一种用来定量测量酶活性的方法，酶活性是酶催化底物转化为产物的速率。
酶活测定的原理是通过测量底物的消耗或产物的生成来间接测量酶催化反应的速率。
酶活测定的原理可以分为两种方法：连续监测法和间断测定法。
1. 连续监测法：连续监测法是指在反应过程中连续测量底物浓度或产物浓度的变化，从而得到酶活性。
常用的连续监测法有光度法、荧光法、滴定法等。
光度法是通过测量酶催化反应后的混合物的吸光度的变化来确定酶活性。
在光度法中，可以选择适当的底物与酶催化反应形成产物，而该产物通常具有一定的吸光度。
通过不断监测反应体系的吸光度或透过率的变化，可以得到随时间变化的底物或产物浓度，并计算出酶活性。
荧光法和光度法类似，不同之处在于荧光法是通过测量荧光物质的荧光发射或吸收的变化来确定酶活性。
荧光法的优点是具有极高的灵敏度和选择性，适用于对底物和产物浓度要求较低的酶活测定。
滴定法是通过在酶催化反应过程中滴加一定浓度的滴定剂来测定酶活性。
滴定剂一般选择可以与底物或产物发生特定反应的化学物质。
当底物滴定到一定的量时滴定剂会发生颜色变化，从而可以通过滴定液的体积与时间的比值来计算酶活性。
2. 间断测定法：间断测定法是在一定时间内采集样品，在样品采集后通过颜色反应等方法测定底物或产物的浓度。
常用的间断测定法有比色法和电化学法。
比色法是通过底物和产物的颜色反应来测定酶活性。
比色法是酶测定中最常用的一种测定方法。
在比色法中，可以选择适当的底物与酶催化反应形成产物，而该产物通常具有一定的颜色。
在固定时间内，收集反应液并停止酶活，然后通过比色分析仪器来测定产物的吸光度或透过率变化，并通过标准曲线计算酶活性。
电化学法是通过通过电极与反应体系接触的方式来测定底物或产物的浓度。
常用的电化学法有电位法和电流法。
在电位法中，通过测量电极的电位变化来确定酶活性。
在电流法中，通过测量通过电极的电流变化来确定酶活性。
除了以上介绍的方法外，还有许多其他酶活测定方法，如色谱法、质谱法等。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活力测定的原理和方法
• 次碘酸钠法：果胶酶水解果胶生成 β - 半乳糖 醛酸，可用次碘酸钠法进行半乳糖醛酸的定量， 从而测定果胶酶活力，对于分离纯化的外切聚 半乳糖醛酸酶也采用本法测定活力。 • 粘度法：果胶被果胶酶水解后粘度下降。粘度 下降至20～80%范围内时，与酶浓度成正比。
七、碱性磷酸酶的活力测定
• 碱性磷酸酶在碱性条件下催化磷酸单脂水解生 成无机磷酸，该酶的测定一般采用 NPP 法或定 磷法。 • 1 、 NPP 法：以对硝基酚磷酸（ NPP ）为底物， 在酶作用下， NPP 水解生成黄色的对硝基酚， 可用分光光度计测定。 • 2、定磷法：以腺苷酸 (AMP)为底物，按上述方 法进行酶反应，生成的磷酸用钼兰定磷法测定 650nm 波长下的光密度变化，从而测定酶活力。
术主要基于酶促反应的初速度原理，下
面介绍两种方法。
定时法
• 定时法是指在线性范围内，定时记录反 应过程中读数的变化（如吸光度），由 于这一变化值直接正比于初速度，故可 分析出相应的物质浓度。 • 这种分析仪多用分光光度法检测或选用 离子选择性电极，对大批量样品进行单 一成分分析或对每一样品进行多因素分 析，效率很高。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
1、一般的连续法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定可是个超级重要的事儿呢！就好像我们要了解一个运动员有多厉害，得看他在赛场上的表现一样。
那怎么去测定酶活力呢？嘿，方法可多啦！
一种常见的方法就是比色法。
这就好比我们通过观察颜色的变化来判断事情的进展。
通过特定的化学反应，让酶和底物作用，然后产生一些有颜色变化的物质，我们根据颜色的深浅来衡量酶活力的高低。
你说神奇不神奇？
还有一种是荧光法，哇哦，这就像是在黑暗中找到那闪闪发光的宝贝。
利用酶反应会引起荧光强度的变化，从而准确地知道酶活力的大小。
再说说同位素测定法，这可有点高科技的味道了呢！就如同有个超级侦探在追踪着微小的线索。
通过标记同位素，然后观察它们的变化，来确定酶活力。
另外，电化学法也不能小瞧呀！它就如同一个敏锐的传感器，能精确地捕捉到微小的电信号变化，进而反映出酶活力的情况。
这些方法各有各的奇妙之处，各有各的用处。
我们可以根据不同的酶、不同的实验条件去选择最合适的方法。
难道不是吗？
酶活力测定在生物、医学、化学等领域都有着至关重要的地位。
它就像是打开一扇门的钥匙，让我们能深入了解那些神奇的生物化学反应。
没有准确的酶活力测定，我们怎么能更好地研究疾病的发生机制？怎么能研发出更有效的药物？怎么能推动科学的进步呢？
所以啊，我们一定要重视酶活力测定，不断探索和改进测定的方法。
让我们能像超级英雄一样，揭开酶的神秘面纱，为人类的健康和科学的发展贡献自己的力量！这是多么有意义的事情啊！。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告酶活力测定实验报告引言：酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率，对于维持生物体内的代谢平衡起着重要的作用。
酶活力测定实验是一种常用的实验方法，通过测量酶催化反应中底物消耗量或产物生成量的变化，来间接反映酶的活性水平。
本实验旨在通过测定过氧化氢酶（catalase）在不同温度下的活性变化，探究酶活性与温度之间的关系。
材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴槽。
2. 实验试剂：过氧化氢酶溶液、过氧化氢底物溶液、磷酸盐缓冲液。
3. 实验步骤：a. 在分光光度计中设置波长为240nm。
b. 准备一组含有过氧化氢酶、过氧化氢底物和磷酸盐缓冲液的混合溶液，作为实验组。
c. 将实验组的混合溶液分别置于不同温度的恒温水浴槽中反应一段时间。
d. 取出反应后的混合溶液，通过分光光度计测定其吸光度，得到反应速率。
e. 重复以上步骤，分别在不同温度下进行实验，并记录实验数据。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同温度下过氧化氢酶的活性变化曲线。
实验结果显示，随着温度的升高，过氧化氢酶的活性呈现出先增加后降低的趋势。
在较低温度下，酶的活性较低，反应速率较慢；随着温度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速率也随之增加；然而，当温度超过一定范围后，酶的活性开始下降，反应速率逐渐减小。
这一结果可以解释为酶的活性受到温度的影响。
酶是一种蛋白质，其活性受到温度的变化而变化。
当温度升高时，酶分子内部的振动加剧，使得酶与底物之间的碰撞频率增加，酶活性增强；然而，当温度过高时，酶分子的结构开始发生变化，部分酶分子失去了原有的构象，导致酶活性下降。
这种变化可能是由于酶分子的部分构象发生变化，使得酶活性中心的空间结构发生改变，从而影响了酶与底物之间的互作用。
此外，实验结果还表明，酶活性与温度之间存在一个最适温度。
在最适温度下，酶的活性达到最高点，反应速率最快。
这是因为在最适温度下，酶分子的结构处于最稳定的状态，酶活性中心与底物之间的互作用最为紧密，因此反应速率最高。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。
将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。
分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。
（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）（Na+＋K+）－ATPase活性的测定1、试剂（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L 蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。
酶活性检测——精选推荐
酶活性检测④分光光度法利⽤底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
⼏乎所有的氧化还原酶都使⽤该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，⽽NAD和NADP在该波长下⽆吸收，脱氢酶类可⽤该法测定。
该法测定迅速简便，⾃动扫描分光光度计的使⽤对酶活⼒的快速准确的测定提供的极⼤的⽅便。
酶在⾷品加⼯中的作⽤就像⼀把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作⽤我们要加强，在⾷品加⼯过程中添加酶制剂，使其作⽤充分发挥;消极作⽤我们要尽量避免，可以通过加热等⽅法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应⽤于⾷品加⼯，研究酶的性质是⼗分必要的。
⽽紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要⽅法之⼀。
下⾯我们来介绍⽤-可见分光光度计测定酶活的具体⽅法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β⼀半乳糖苷酶β⼀半乳糖苷酶，⼜称乳糖酶(Lactase)。
能⽔解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从⽽提⾼乳制品的可消化性，⽤于低乳糖⽜奶和⾮结晶型浓缩⽜奶的⽣产及奶酪风味的改变，同时还可⽤于⽣产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活⼒。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lµmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活⼒单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是⼀种⼗分重要的⽣物体防⽌氧化损伤的酶类，是⽣物体内超氧阴离⼦清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD⼴泛存在于各类⽣物体内，所有好氧微⽣物细胞中都含有SOD。
⾃1969年Mccord等⼈⾸次发现了SOD ⽣物活性后，医学界对其医疗作⽤做了许多研究，证明它具有抗衰⽼、抗肿瘤、抗辐射、抗缺⾎、提⾼⼈体免疫⼒等作⽤，被专家称为21世纪最有前途的药⽤酶。
欧美国家已开始将其应⽤于医疗、⾷品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加⼊待测SOD样液，再加⼊10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒⼈光径lcm 的⽐⾊杯，在325nm波长下每隔30s测⼀次A值。
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色素原底物
4-硝基磷酸酚钠盐
3-羧基-γ-L-谷氨酰对硝 基苯胺
2-氯-硝基苯-α-半乳糖麦芽糖苷
待测酶 ALP GGT
AMS
产物的毫摩尔吸光系数 PNP（4-硝基酚405nm）,18.5 5-氨基-2-硝基苯甲酸,405nm,9.87
2-氯酚（2-CP405nm）,6.2
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3.基于氧的消耗 氧化酶在催化反应时会不断消耗氧气，可以设计氧电极来
由于NAD（P）+或NAD（P）H在340nm的光吸收特性，很容易进 行连续监测，因此它是最常用的指示酶，过氧化物酶（POD）也 可做指示酶。下表列举了需要指示酶的酶偶联方法来测定酶活性
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举例
待测酶 丙氨酸氨基转移酶
脂肪酶 5’-核苷酸酶
测定方法
IFCC推荐法 GK-GPO-POD法 5’-IMP作底物的 NP-XOP-POD法
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（二）连续监测法
1.原理 连续监测法是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度 等）下孵育，每隔一定时间（2-60s）连续测定酶促反应过程 中某一底物或产物的特征信号（如NADH在340nm的吸光度）的 变化，从而计算出每分钟的信号变化速率 2.酶促反应动力学曲线
一个典型的酶促反 应过程一般包括延滞 期、线性期和非线性期
2.线性期
是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。
此期底物虽被不断消耗但还不足以明显改变酶促反应的速度，即
以初速度进行
3.非线性期
随着反应的进行，底物消耗越来越明显，反应速度明显下降
而进入非线性期。酶浓度越高在选定条件下线性期就越短。其他
造成进入非线性期的原因有可逆反应增强、产物抑制增加、酶变
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1.化学法
大多数定时法都是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底 物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测。 也有个别酶类不终止反应，加入与酶促反应无关的试剂，但 能与酶促反应的某一产物反应生成有特征性的化合物。
例如：①胆碱酯酶催化酰基硫代胆碱类底物后，生成的硫代 胆碱（SCh）与5，5-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反 应，生成黄色阴离子5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-TNBA）
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若把A/t以ΔA/min表示，则此定时法测定酶活性的计算公式与连续监测法相同
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3.定时法与终点法和两点法的区别
➢定时法 是经过一定时间（固定的时间）反应后终止反应 ➢终点法 指反应基本达到平衡，信号变化很小，但可以不需 要终止反应 ➢两点法 监测反应过程中的两个点，即某一段时间内的底物 或产物的变化
连续监测氧的消耗速度 4.其他
胆碱酯酶催化乙酰胆碱产生乙酸，造成pH下降，可以用pH 差示法测定胆碱酯酶。脱羧酶在反应过程中产生CO2，可以用 量积法测定
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（二）间接法
是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质， 需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为 有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的 酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法
补充2 酶催化活性的测定方法
Байду номын сангаас
目的
掌握定时法和连续监测法测定酶活性的原理及方法
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一、测定酶促反应速度的两类方法 （一）酶促反应速度的表示方法
单位时间的底物的消耗量（-d[S]/min）
单位时间的产物的生成量（d[P]/min）来表示 （二）测定方法分类
定时法 在一定时间内通过测定总变化量再计算出速度.
②酸性磷酸酶测定，利用α-萘酚磷酸盐做底物，经酸 性磷酸酶水解后释放萘酚，与试剂中的固红TR发生偶氮反应， 生成黄色化合物
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2.酶偶联法
在酶活性测定时，常采用另一个（指示酶）或几个酶（辅助 酶和指示酶）将测定酶的某一产物转化为新的产物，当其他酶的 反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速 度来代表待测酶的活性。可以表示为： ➢指示酶是指能监测反应速度的酶 ➢辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个，也可以不需要辅助酶
连续监测法 直接用来测定速度
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（一）定时法
1.概念 在足量的底物系统中，加入一定量的酶试剂，反应一 定时间后，加入终止剂终止反应，然后测定底物的消耗量或产 物的生成量 2.酶活性的结果计算
假设某一样品的酶活性为X（U/L），取样品量Vs毫升与底 物缓冲液Vr毫升孵育，经过t分钟反应，加入终止液 Ve(ml)， 检测到产物净吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数为 ε （终点法的摩尔消光系数一般可通过带标准求得）比色皿光径 为b(cm)
例如LD、G-6-PD、α-HBD、AD、SD、GLDH等
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2．基于人工合成色素原底物反应原理
一些水解酶类或转移酶类经过酶促反应将化合物中的某 一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物。 人们把这类底物称为色素原底物。根据这一原理，人们有意 识地合成一系列底物用来测定酶活性，即人工合成色素原底 物，利用这类底物测定的酶
性失活增加、酶聚合或解离增加医学等ppt等
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（二）连续监测法酶活性的结果计算
假设某一样品的酶活性为x（U/L），取样品量Vs与底物缓冲液 Vr孵育，延滞期为t0分钟，测定间隔时间为t1分钟，读数次数为n， 每间隔时间吸光度变化平均值为A，该产物的摩尔消光系数为ε比 色皿光径为b（cm）。反应速度分别用产物的生成速度和样品中酶 的催化能力来表示
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二、酶活性测定方法原理
（一）直接法
根据待测酶的酶促反应底物或产物有特征性的理化性质， 然后通过特殊的仪器直接检测
1.基于NADH或NADPH的反应原理 NADH或NADPH在340nm处有特 异吸收峰，而NAD+或NADP+只在260nm处有明显的吸收峰，监 测340nm吸光度变化可以反应NADH或NADPH的变化。利用该原 理可以测定以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的氧化还原酶
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1.延滞期 ①对单一酶促反应而言，是指酶促反应从开始到达最大反应
速度所需要的间，包括酶催化位点的暴露、底物解离后与酶结合
位点的结合、酶与辅酶的结合、酶的激活等等
②对于酶偶联反应而言，延滞期还包括中间产物堆积到一定
程后，导致指示反应速度增加，直到与待测酶酶促反应速度达到
平衡所需的时间。一般来说，辅助酶越多，延滞期越长