基因组文库和cDNA文库的比较
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
基因文库的构建
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(1161)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。
答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中所磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol 裂解液溶解样品，充分吹打混匀。
②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。
③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要集中在水相中。
④将水相转移至新的离心管中，加入等体积丙酮，室温放置10min。
⑤4℃，10000g离心10min，此时可在离心管仔细分析底部观察到白色沉淀，即为RNA。
⑥用75冷的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。
⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。
（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，跑琼脂糖凝胶电泳，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。
②吸光度检测：使用紫外波谱光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他物质的污染可以接受。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 衰减子在真核基因调控中起负调节作用。
（）答案：错误解析：真核基因无衰减子。
2. 一个基因的内含子能够作为另一个基因的外显子。
（）答案：正确解析：内含子是指断裂基因的非编码序列，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切压碎，故成熟mRNA上用无内含子编码序列。
外显子是真核抗原生物基因的一部分。
它在片断后会被保存下来，并可在蛋白质生物合成关键步骤中被表达为蛋白质。
cDNA文库和基因组文库比较
个人收集整理-ZQ文库和基因组文库比较文库:以为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成，与适当地载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部信息地克隆集合称为该组织细胞地文库.基因组文库: 一个生物体地基因组用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体分子中，所有这些插入了基因组片段地载体分子地集合体，将包含这个生物体地整个基因组，也就是构成了这个生物体地基因文库. b5E2R。
基因组文库与文库地比较:基因组文库地优点相对于文库,基因组文库地优点: 克隆只能反映着地分子结构,没有包括基因组地间隔序列, 文库中,不同克隆地分布状态总是反映着地分布状态,即:高丰度地克隆,所占比例较高,分离基因容易;低丰度地克隆,所占比例较低,分离基因困难; 从克隆中,不能克隆到基因组中地非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列地结构与功能. p1Ean。
文库地主要优点：①文库以为材料,特别适用于某些病毒等地基因组结构研究及有关基因地克隆分离.②文库地筛选比较简单易行.③每一个文库都含有一种序列,这样在目地基因地选择中出现假阳性地概率就会比较低,因此阳性杂交信号一般都是有意义地,由此选择出来地阳性克隆将会含有目地基因.DXDiT。
④文库可用于在细菌中能进行表达地基因地克隆,直接应用于基因工程操作.⑤克隆还可用于真核细胞地结构和功能研究.克隆地主要地缺点：文库所包含地遗传信息要远远少于基因组文库,并且受细胞来源或发育时期地影响. 文库虽能反映地分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列地结构与功能方面信息. 在文库中,相应于高丰度地克隆所占地比例比较高,分离起来比较容易,而相应于低丰度地克隆所占地比例则比较低,因此分离也就比较困难.RTCrp。
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基因组文库和cDNA文库的比较
大肠杆菌 RNaseH酶 降解取代法
Oligo寡聚 引物引导法
PCseH
酶 降 解 取 代 法02 构建Oligo寡 聚 引能反映 mRNA信息，但 不能直接获得基 因的内含子序列 和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占 比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克 隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK YOU!
部分资料从网络收集整 理而来，供大家参考，
感谢您的于筛选困难、重组效率低、文 库不易贮存，Cosmid使用不如λ 噬菌体载体普母人工染色库：以mRNA为模板， 经反转录酶催化，在体外反转录 成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一 段cDNA，并能繁殖扩增，这样 包含着细胞全部mRNA信息的 c的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒概率低。
简易。其克隆bibliotek
的十分之一。
概率高。
真核生物NA病毒的基 因组结构和基因克 隆分离。03 基因组优点基因组含有 全部基因，
cDNA只含有 全部蛋白质编码 的结构基因且受
基因组和cDNA的比较目录CONTENTS01 基因组 02 cDNA 03 两者比较
01基因组概念 构建（原核） 构建（真核）0载体贮存 在一个受体菌的群体中（1-f）, 实际克隆段化
物理学方法：机械类或超声波等 生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体 或λ载体。
重组核采用 质粒载体或λ载体）。下面 介绍三种方法：
噬菌体cDNA文库
噬菌体cDNA文库cDNA文库（complementary DNA library）以组织中的mRNA 为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。
这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。
代表特定细胞或组织中mRNA的文库。
cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、特定组织、特定的发育时期基因表达的前提和基础。
传统的筛库方法是将克隆高密度影印到尼龙膜上进行菌落原位杂交筛选。
此方法工作量大，而且必须使用放射性同位素。
现如今，作为大容量文库（≥108克隆）中选择特异的结合肽或蛋白的强大工具，噬菌体展示技术的到来位cDNA克隆基因表达提供了发展的机会。
一．cDNA文库的优点1. 使遗传物质为RNA病毒可建立文库；2. 因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；3. 从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。
4. 建库时已排除了其他的RNA，使假阳性率降低。
5. cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。
二．cDNA文库和基因组文库的区别时效性代表某一时期特定细胞或组织中mRNA的转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因。
包含该生物所有基因序列组成不同无间隔序列和调控区等非编码区可显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一个克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的临近DNA序列。
如何选择在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特异表达的基因时应用cDNA文库研究mRNA不存在的序列及基因组做图时必须构建基因组文库三．用于噬菌体cDNA文库展示的载体1. 丝状噬菌体因为全长cDNA包含在3’末端的翻译终止子，原核表达时缺乏合适的核糖体结合位点（若该cDNA来源于真核细胞），确保cDNA在噬菌体表达的最实际的方法是将5’末端与载体基因融合。
基因组文库和cDNA文库的比较
基因组文库和cDNA文库的比较首先，让我们了解一下基因组文库和cDNA文库的定义和构建方法。
1.基因组文库：基因组文库是整个基因组的DNA序列的集合，包含了一个生物体的全部遗传信息。
构建基因组文库的过程中，需要将整个基因组的DNA分解成小片段，并将其插入一个合适的DNA载体（如噬菌体、质粒或染色体）。
随后，DNA片段和载体将被放入宿主细胞（如大肠杆菌），产生许多基因组文库的克隆。
这些克隆可用于后续的DNA测序、定位和功能研究等。
-包含了一个生物体的全基因组DNA序列，不仅包括编码蛋白质的外显子，也包含调控序列、非编码RNA等。
-克隆数目较大，能覆盖整个基因组的序列。
-信息量大，能提供全面的基因组遗传信息。
-由于涵盖了大量非编码序列，分析起来比较复杂。
2.cDNA文库：cDNA文库是由转录mRNA后得到的互补DNA（cDNA）构建而成的。
转录是由DNA模板合成RNA的过程，其中mRNA是转录出的可翻译成蛋白质的分子。
cDNA文库的构建过程中，需要在转录过程中加入反转录酶，用于合成cDNA。
此后，cDNA片段会被插入到DNA载体中，并转化到宿主细胞中。
cDNA文库可用于研究特定时期或类型细胞的基因表达情况，并逆推分析源自该时期或类型细胞的mRNA信息。
同样，cDNA文库可用于DNA 测序、蛋白质表达等研究。
cDNA文库的主要特点：-反映了特定时期或类型细胞的基因表达情况。
-由于只含有编码蛋白质的序列，分析起来相对简单。
-cDNA文库总体克隆数较少，故无法覆盖全基因组的信息。
-最初的RNA模板需经过反转录，过程中可能有一定的误差和损失。
接下来我们对比基因组文库和cDNA文库的优缺点和应用：1.优点：-信息量大，提供更全面的基因组遗传信息。
-适用于定位基因和研究调控序列、非编码RNA等。
cDNA文库：-分析相对简单，只包含编码蛋白质的序列。
-反映特定细胞或时期的基因表达情况。
2.缺点：-复杂性高，涵盖了大量的非编码序列。
为什么cDNA文库可以进行物种间的基因交流,而基因组文库只有部分基因可以
为什么cDNA文库可以进行物种间的基因交流，而基因组文库只有部分基因可以？
基因交流就是基因重组。
某种生物的基因组文库包含着这种生物的所有基因，是用限制酶剪切然后连接上运载体然后导入受体细胞得来的。
要知道，我们不能保证所有的基因都能被限制酶剪切完整，也就是说并不是所有的基因的两端都恰好能被那两百种限制酶中的某一种识别，也就是说，基因组文库中的所谓基因其实只能够说是DNA片断，这些片断可能正好是一个完整的某基因，也有可能是某基因的一个部分，还有可能包含有几个基因或他们的片断等，在这里，只有那些包含完整基因的片断才能够用于基因交流。
所以，基因组文库中的“基因”只有部分能够在物种间进行基因交流另外还有一种理解是：一个完整的基因具有非编码区和编码区两个区域。
基因根据其功能大致可以分为三个部分：基因上游和基因下游是非编码区，前者有启动子，是调控基因。
决定转录的开始后者有终止子，终止基因转录中间部分编码区，是结构基因用来转录出mRNA，其中还具有不能翻译成蛋白质的内含子。
根据所学的知识，我们可以知道所有生物共用一套遗传密码，cDNA在反转录过程中只能反转录出能够转录成mRNA的外显子。
说明cDNA全部的核苷酸序列可以转录成mRNA，并且成功翻译成蛋白质。
如果是基因文库中的DNA，由于内含子、启动子、终止子等调控基因的存在，其存在的核苷酸序列不像遗传密码一样所有的动物共用，因而只有部分没有调控基因的DNA才可进行基因交流。
分子生物学 论述题
分子生物学是生命科学中最为基础的学科之一，主要研究生物体的分子组成、结构、功能以及分子间的相互作用。
以下是针对分子生物学的一些论述题的详细回答：1. 什么是cDNA文库？它与基因组文库有何差别？cDNA文库是由逆转录酶将mRNA转录成cDNA后，将这些cDNA分子插入到载体中构建而成的。
它代表了某一组织或细胞类型中的基因表达信息。
而基因组文库则是直接将基因组DNA切割成片段，插入到载体中构建的文库，它包含了某个生物个体所有基因的遗传信息。
两者的主要差别在于cDNA文库只包含表达的基因，而基因组文库包含了所有基因，包括未表达的基因。
2. 以人类基因组和拟南芥基因组为例，说明你对生物基因组全序列测定工作的科学意义的认识。
生物基因组全序列的测定对于理解生物体的遗传信息有着重要的科学意义。
人类基因组的全序列测定帮助我们理解了人类基因的多样性，以及基因与疾病之间的关系，为疾病的诊断、治疗和预防提供了重要的理论基础。
而拟南芥基因组的全序列测定则为我们提供了一个模式植物基因组的完整图谱，对于研究植物基因的功能、植物生长发育的分子机制以及植物与环境的相互作用具有重要意义。
3. 什么是环状DNA分子？它的结构特点与原核生物DNA相似吗？环状DNA分子是一种存在于某些病毒和细胞质中的DNA分子，其特点是没有核糖核酸（RNA）和蛋白质与之结合，呈环状结构。
环状DNA分子的结构特点与原核生物DNA相似，都是由双螺旋结构组成，但环状DNA分子通常较小，结构更为紧凑。
4. 真核生物基因组的结构特点是什么？真核生物基因组的结构特点包括：基因通常由编码序列和非编码序列组成，编码序列包括外显子和内含子，外显子被转录和翻译成蛋白质，而内含子则被剪接掉；基因在染色体上呈线性排列，由启动子、编码序列和终止子组成；真核生物基因的转录产物多为单顺反子RNA，即转录产物中包含有内含子和外显子，这与原核生物的转录产物不同，原核生物的转录产物为多顺反子RNA，不包含内含子和外显子。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(2820)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。
A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。
要求表达的重组蛋白C端带His标签。
答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后必须添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。
（2）His标签座落在酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不颠倒。
（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。
上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。
下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. DNA是生物界中唯一的遗传物质。
（）答案：错误解析：RNA也可以做遗传物质。
2. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不相同的。
（）答案：错误解析：碱解法和煮沸法分离质粒DNA的原理是相同的，都是根据染色体DNA的变性和复性差异的原理。
3. 基因表达的最终产物都是蛋白质。
（）答案：错误解析：基因表达的即便最终产物不都是蛋白质，有时是RNA。
4. 原核生物应急反应信号是鸟苷四磷酸和鸟苷五磷酸。
它们的作用范围十分广泛，不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批操纵子的转录，属于超级调控因子。
基因组文库与cdna二课的区别
基因组文库与cdna二课的区别基因组文库与cDNA文库是两种常用的DNA文库构建方法，在基因组学和转录组学研究中扮演着重要的角色。
本文将从构建方法、应用领域和优缺点三个方面对两者进行比较。
一、构建方法1. 基因组文库构建方法：基因组文库是由整个基因组DNA片段组成的文库。
构建基因组文库的关键步骤包括DNA提取、DNA片段切割、连接到载体、转化到宿主细胞等。
其中，DNA片段切割通常使用限制性内切酶，将基因组DNA切割成特定大小的片段，然后将片段连接到载体上，最后转化到宿主细胞中。
2. cDNA文库构建方法：cDNA文库是由转录本（mRNA）反转录合成的互补DNA（cDNA）片段组成的文库。
构建cDNA文库的关键步骤包括RNA提取、反转录、合成第一链、合成第二链、连接到载体、转化到宿主细胞等。
其中，反转录是将mRNA作为模板，使用逆转录酶合成cDNA的过程，合成的cDNA片段具有转录本的特异性。
二、应用领域1. 基因组文库的应用领域：基因组文库广泛应用于基因组测序、基因定位、基因组结构和功能研究等。
通过对基因组文库进行测序，可以获取到整个基因组的序列信息，进而进行基因组注释、基因定位、重测序等研究。
此外，基因组文库还可用于构建比较基因组文库，用于不同物种之间的基因演化和功能保守性研究。
2. cDNA文库的应用领域：cDNA文库主要应用于转录组学研究，可以用于测定不同组织、不同生长阶段或不同环境条件下基因的表达情况。
通过对cDNA文库进行测序，可以获取到转录组的信息，进而进行基因表达差异分析、功能注释、代谢途径分析等研究。
此外，cDNA文库还可用于筛选和克隆特定基因。
三、优缺点比较1. 基因组文库的优缺点：优点：基因组文库包含了整个基因组的信息，可以全面了解基因组的结构和功能；适用于基因组水平的研究，如基因组测序和基因定位等。
缺点：基因组文库的构建比较复杂，需要大量的DNA样品；基因组文库中包含大量的非编码区域，测序成本相对较高。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪 切可以非常随机地进一步将长片段切割成 小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶 是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解
• 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非 随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基 因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体 的片段），需要进行部分酶解，即通过合理 使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶 切片段的大小
• 也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组 体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
cDNA和基因组文库DNA的构建
2：cDNA第二链的合成
• 2 . 1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、
• 10mMol/L mgcl2 70ul • 2mM/L Tris-Hcl(PH7.4) 5ul
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小， <8kb 9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,T-载体,
• 2 . 8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到 已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。 [第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg xμg)=cDNA第二链合成量/μg x表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的 70~80% 2 . 9.用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物 进行抽提。
5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法 分离cDNA
•
Sepharose CL-4B柱的制备 5 . 1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用 无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的 棉拭子吹至吸管狭窄端。 5 . 2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有 0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置 的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体。
基因工程知识点
名词解释1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。
3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。
4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。
5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。
6.DNA连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。
7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
8.多克隆位点：是包含多种同一个限制性酶切点的一段很短的DNA序列9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。
10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。
这个标记的核酸分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3‟端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
基因组文库和cDNA文库的比较(方案).ppt
01基因组概念 构建（原核） 构建（真核）0载体贮存 在一个受体菌的群体中（1-f）, 实际克隆合 成 方 法
大肠杆菌 RNaseH酶 降解取代法
Oligo寡聚 引物引导法
PCseH
酶 降 解 取 代 法02 构建Oligo寡 聚 引比较cDNA优点 基因组优点谢谢 精选文档尽在此间
材料影响cDNA能反映 mRNA信息，但 不能直接获得基 因的内含子序列 和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占 比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克 隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK Y于筛选困难、重组效率低、文 库不易贮存，Cosmid使用不如λ 噬菌体载体普母人工染色库：以mRNA为模板， 经反转录酶催化，在体外反转录 成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一 段cDNA，并能繁殖扩增，这样 包含着细胞全部mRNA信息的 c制备基因组DNA并片段化
物理学方法：机械类或超声波等 生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体 或λ载体。
重组核采用 质粒载体或λ载体）。下、筛选
假阳性概率低。
简易。其克隆
概率高。
真核生物NA病毒的基 因组结构和基因克 隆分离。03 基因组优点基因组含有 全部基因，
cDNA只含有 全部蛋白质编码 的结构基因且受
公式:N=ln的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒第 一 链
基因工程 简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
基因文库名词解释
基因文库
基因文库(gene library)是指在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA(或来自某一组织所有不同的mRNA的每一种cDNA分子)所形成的全部DNA片段克隆的集合体。
基因文库包括基因组文库和部分基因文库。
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。
如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA 文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。
cDNA 文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。
用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
同一定义也适用于某种生物的线粒体DNA 或叶绿体DNA的基因文库。
由于制备DNA片段的切点是
随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。
基因文库有关技术的建立及应用虽然只有几年历史，但是它作为重组DNA技术应用的一个重要方面已经显示了它在解决分子遗传学中的理论问题和遗传工程中的实际问题上的巨大潜力。
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假阳性概率低。
简易。其克隆
概率高。
真核生物NA病毒的基 因组结构和基因克 隆分离。03 基因组优点基因组含有 全部基因，
cDNA只含有 全部蛋白质编码 的结构基因且受
02 构建双 链DNA合 成 方 法
大肠杆菌 RNaseH酶 降解取代法
Oligo寡聚 引物引导法
PCseH
酶 降 解 取 代 法02 构建Oligo寡 聚 引的分离
包括mRNA、tRNA、rRNA
cDNA第一条链的合成
oligo引导合成法、随机引物引导合成法
双链cDNA的合成
四种常用方法
cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒第 一 链
公式:N=ln（1-P）/ln（1-f）, 实际克隆段化
物理学方法：机械类或超声波等 生物化学方原核生物基因组较小，一般采用质粒载体 或λ载体。
重组CONTENTS01 基因组 02 cDNA 03 两者比较
01基因组概念 构建（原核） 构建（真核）0载体贮存 在一个受体菌的群体中反映 mRNA信息，但 不能直接获得基 因的内含子序列 和基因编码区外 A的
cDNA克隆,所占 比例较高,分离基
因容易;低丰度 mRNA的cDNA克 隆,所占比例较低,
分离基因困难;
感谢聆听！
THANK YOU!