细胞转染Cell Transfection_PPT幻灯片

（5） 氮磷（N/P） 比
• N/P 比是转染效率的关键（为了换算方便， 一般以 DNA/转染试 剂质量比表示） ， 在一定比例范围内转染效率随 N/P 比成比例 增高， 之后达到平值， 但毒性也随之而增加， 因此在实验之前 应根据推荐比例， 确定本实验的最佳转染比例。
（6） DNA 质量
• DNA 质量对转染效率影响非常大。 一般的转染技术（如脂质体等） 基于电 荷吸引原理，如果 DNA 不纯， 如带少量的盐离子， 蛋白， 代谢物污染都会 显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
细胞培养
• HeLa， HepG-2， NIH /3T3 细胞培养于含 10% 新生小牛血清的 DMEM 高糖培养液， 37 C ， 5% CO2， 90% 相对湿度培养箱中 . 在解冻小鼠 ES 细胞前， 先培养饲养层细胞 C57BL， 待长满后， 用 含 10 ug /mL 的mitomycin C处理 2 ~ 2. 51h， 用 37 C 预热的 PBS 漂洗两次， 加普通培养液过夜培养 . 第二天， 解冻小鼠 ES 细胞， 在含 10% 胎牛血清7 . 175 X 109 pmoI /L LIF饲养层上培养 .
2． 细胞状态
• 一般低的细胞代数（<50） 能确保基因型不变。 最适合 转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞， 细胞生长旺盛， 最容易转染。 同一种系的细胞株， 在各 实验室不同培养条件下， 其生物学性状发生不同程度的 改变， 导致其转染特性也发生变化。 因此， 如果发现转 染效率降低， 可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳 结果。
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转染效率的因素影响
• 转染试剂 细胞状态 转染方法 载体构建
• 细胞培养物 细胞密度 血清 抗生素 氮磷比 DNA质量
1． 转染试剂
• 不同细胞系转染效率通常不同， 但细胞系的选择通常是根据实验 的需要， 因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合 的转染试剂。 每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株 列表和文献， 通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。 当然， 最适合的是高效、 低毒、 方便、 廉价的转染试剂。
稳定转染(stable transfection)
• 稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一 种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量 低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转 移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH）， 胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
（4） 抗生素
• 细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染， 但是这些添加剂可能对转 染造成麻烦。 比如青霉素和链霉素， 就是影响转染的培养基添加物。 这 些抗生素一般对于真核细胞无毒， 但有些转染试剂增加了细胞的通透性， 使抗生素可以进入细胞。 这可能间接导致细胞死亡， 造成转染效率低。 目 前转染试剂因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来 操作， 非常方便， 省去了污染等麻烦
细胞转染条件的材料
真核表达质 粒 PEGFP-N 带有表达绿色荧光蛋白 的 EGFP 基因，用 于细胞转染 后衡量转基因的表达水平， 打靶载体（ Target Vector， 如图 2 所示） 在靶基 因的同源序列之间插入新霉素抗性基因（ NEO）作为正筛选的标志， 在同源 序列的 3'端插有疱疹病毒胸苷激酶（ HSV-tk）基因作为负选择， 反复筛选后 得到的细胞克隆数用 于衡量转基因的表达水平 .
（2） 细胞密度
• 细胞密度对转染效率有一定的影响。 转染时过高或者过低的细胞密度会导 致转染效率降低， 乃至表达水平偏低。 因此如果选用新的细胞系或者新的 转染试剂，最好能够进行优化实验并为Байду номын сангаас后的实验建立一个稳定方法， 包 括适当的接种量和培养时间等等， 总之是尽量在细胞最适的生理状态下转 染， 以求最佳的转染效果。
4． 载体构建
• 转染载体的构建（病毒载体， 质粒 DNA， RNA， PCR 产物， 寡核苷酸等） 也影响转染结果。 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高， 但不同病毒载 体有其特定的宿主， 有的还要求特定的细胞周期 。 除载体构建外， 载体的 形态及大小对转染效率也有不同的影响， 如超螺旋及线性 DNA 对瞬时和稳 定转染的影响。 如果基因产物对细胞有毒性作用， 转染也很难进行， 因此 选择组成或可调控， 强度合适的启动子也很重要， 同时做空载体及其它基 因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。
• 外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存 在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于 启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染 效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分 析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来 帮助检测
细胞转染
• 随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展， 转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常 规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变 分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来 越广泛。
• 转染(transfection)：真核细胞由于外源DNA掺入 而获得新的遗传标志的过程。
瞬时转染(transient transfection)
3． 转染方法
•不同转染试剂有不同的转染方法， 但大多大同小异。 应根据实验室的具 体条件来确定最佳转染条件。
（1） 细胞培养物
•健康的细胞培养物是成功转染的基础。 不同细胞有不同的培养基， 血清 和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度。 推荐在转染前 24 小时分 细胞， 这将提供正常细胞代谢， 增加对外源 DNA 摄入的可能。 一定要避 免细菌， 支原体或真菌的污染。
（3） 血清
• 血清一度曾被认为会降低转染效率， 血清的存在会影响 DNA—转染复合 物的形成， 但只要在 DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或 PBS 来稀
• 释 DNA 和转染试剂就可以了， 在转染过程中是可以使用血清的。 不过要 特别注意： 对于 RNA转染， 如何消除血清中潜在的 RNase 污染是值得关 注的。 通常的， 血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分 的添加物， 对不同细胞的生长作用有很大的差别。 血清质量的变化直接 影响细胞生长， 因此也会影响转染效率。