动物细胞培养基本方法
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
•
•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
•动物细胞大规模培养技术
• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
•动物细胞大规模培养技术
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
•动物细胞大规模培养技术
高一生物动物细胞培养的介绍
高一生物动物细胞培养的介绍高一生物动物细胞培养知识点该知识点包括动物细胞培养的过程､动物细胞培养的条件､动物细胞培养的应用等几个要点知识。
1.动物细胞培养的过程:动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
其基本流程是取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
在培养过程中会出现细胞贴壁生长和接触抑制现象。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
2.动物细胞培养的条件:①无菌､无毒的环境:培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。
此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养:合成培养基成分:糖､氨基酸､促生长因子､无机盐､微量元素等。
通常需加入血清､血浆等天然成分。
③温度:适宜温度:哺乳动物多是36.5℃+0.5℃;pH:7.2~7.4。
④气体环境:95%空气+5%CO2。
O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。
3.动物细胞培养的应用:①用于基因工程(培养它作受体细胞);②制备病毒疫苗､干扰素､生产单克隆抗体,制皮肤细胞等;③检测有毒物质的毒性､培养医学研究的各种细胞等。
【动物细胞培养考点分析】在平常测试中,该知识点有很大比例,多以选择题或简答题的形式出现。
通常考查动物细胞培养过程､条件等相关知识,出题形式灵活,难度不大。
在高考中,从近几年生物试题看,本部分知识一直是高考命题的热点之一,多以简答题形式考查,多以动物细胞培养过程图解结合其他动物细胞技术进行综合考查。
【动物细胞培养知识点误区】对动物细胞培养原理记忆不清､培养过程中胰蛋白酶的作用不清楚及培养条件模糊都是易错的原因。
动物细胞培养基本操作
实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。
本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。
Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
动物细胞培养原理
动物细胞培养原理动物细胞培养是一种重要的生物技术，在医学、生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
动物细胞培养是指将动物体内的细胞分离、培养、传代，并在体外条件下进行细胞生长、增殖和功能表达的过程。
其原理主要包括细胞分离、培养基选择、培养条件控制等几个方面。
首先，动物细胞培养的第一步是细胞的分离。
细胞分离可以通过机械法、酶解法或化学法来实现。
其中，酶解法是最常用的方法，通过特定的酶对细胞外基质进行消化，使细胞从组织中脱落，从而得到单个的细胞。
其次，培养基的选择对动物细胞的培养至关重要。
培养基是提供细胞生长所需的营养物质、生长因子、激素和矿物质的培养液。
不同类型的细胞需要不同的培养基，常用的培养基包括DMEM、MEM和RPMI-1640等。
在培养基中还需要添加适当浓度的血清、抗生素和其他辅助因子，以维持细胞的正常生长和增殖。
另外，培养条件的控制也是动物细胞培养的关键。
细胞的培养需要在恒定的温度、湿度和二氧化碳含量下进行。
一般来说，37摄氏度是最适宜的培养温度，培养箱中的湿度和二氧化碳含量也需要进行精确的控制。
此外，细胞的传代和细胞培养过程中的细胞密度、通气和培养液的更换频率等因素也需要严格控制。
在动物细胞培养过程中，细胞的形态、生长速率和功能表达都受到培养条件的影响。
因此，合理的培养条件和培养基的选择对于细胞的生长和功能表达至关重要。
在实际操作中，需要根据不同类型的细胞和研究目的进行合理的培养条件设计和优化。
总之，动物细胞培养是一项复杂而又重要的生物技术，其成功与否直接关系到后续实验的结果和应用的效果。
只有深入理解动物细胞培养的原理，并且严格控制培养条件，才能够保证细胞的正常生长、增殖和功能表达，为科研和应用提供可靠的细胞资源。
希望本文对动物细胞培养原理有所帮助，谢谢阅读。
常用的五种动物细胞培养方式
•一、半连续式培养1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。
采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。
在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。
或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。
剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。
在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。
2.半连续式特点：·培养物的体积逐步增加；·可进行多次收获；·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。
该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。
二、连续式培养1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。
该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。
理论上讲，该过程可无限延续下去。
2.连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。
稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。
在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。
动物细胞培养的基本方法
膜式生物反应器
在动物细胞培养过程中，会产生一些代 谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产 物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设 计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有 害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长 至更高密度，同时可根据需要选用不同相对 分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞 分离开。
第五节 动物细胞培养的基本方法
一 细胞分离
1 离心分离法
用于从含有细胞的体液如血液、羊水、 胸腹水中分离细胞。一般用800～1000rpm 离心5～10min。
2 消化分离法
先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化 液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲 液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细 胞。 常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰 酶－柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、 木瓜蛋白酶等。
已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫
疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红 细胞生成素、单克隆抗体等产品。
依细胞种类：原代培养、传代培养 依培养基：液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅 拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固 定床或流化床培养。 生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。
2 细胞的复苏
复温速率
复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。 一般来说复苏速度越快越好。 常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完 成复温。
第六节
动物细胞大量培养的 方法和操作方式
动物细胞大规模培养：
在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等）， 在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大 量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目 前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴 肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、 cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细 胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依 赖)等。
简述动物细胞培养过程中细胞复苏,传代,冷冻的操作方法
简述动物细胞培养过程中细胞复苏,传代,冷
冻的操作方法
动物细胞培养过程中的细胞复苏、传代和冷冻是常见的操作步骤。
具体方法如下：
1. 细胞复苏：
a. 将冷冻保存的细胞样品快速解冻，可以将冰冻管置于37°C的水浴中缓慢解冻。
b. 解冻后，将细胞迅速转移到含有预暖的培养基的离心管中。
c. 用培养基轻轻洗涤细胞，并将其移至培养皿中，使细胞附着于培养器皿表面。
d. 增加足够的预热培养基，将细胞放回合适的培养条件中进行复苏。
2. 细胞传代：
a. 当细胞达到适当的密度或已达到培养器皿的最大生长容量时，需要进行细胞传代。
b. 首先，先用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和细胞碎片。
c. 使用无菌酶消化液（如胰蛋白酶）轻轻润湿细胞，然后加入等量的无菌培养基来停止消化。
d. 耐心地将细胞悬浮液吸取并转移到新的培养皿中，保持适当的稀释比例，并加入新的预热培养基。
e. 将新的培养皿放入培养箱中，提供适当的温度、湿度和氧气供应。
3. 细胞冷冻：
a. 将细胞按照细胞传代的方法进行收获和洗涤。
b. 用细胞冻存试剂（如DMSO）缓慢添加到细胞悬浮液中，最终细胞密度通常为1-2×10^6个细胞/mL。
c. 将细胞悬浮液转移至预冷的冻存管中。
d. 快速将冷冻管放入冷冻等温器中，以确保细胞迅速冷冻。
e. 细胞冷冻后，将冷冻管转移到液氮罐中进行长期储存。
请注意，动物细胞培养的具体操作方法可能因细胞类型和研究需要而有所不同。
在进行这些操作之前，应仔细阅读并遵守相应的实验室指南和安全操作规程。
动物细胞培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本原理和方法。
2. 熟悉动物细胞培养过程中常用的仪器和试剂。
3. 通过动物细胞培养实验，了解细胞生长、增殖、分化的过程。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物组织或器官中的细胞取出，在体外模拟体内环境，使其在适当的营养和条件下生长、增殖、分化。
动物细胞培养是生物学、医学、药理学等领域的重要研究手段。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、胰蛋白酶。
2. 仪器：超净工作台、细胞培养箱、移液器、培养皿、显微镜等。
四、实验方法1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，用无菌生理盐水洗涤，加入适量DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中复苏。
2. 细胞传代：将复苏后的细胞用胰蛋白酶消化，加入适量的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 细胞观察：在显微镜下观察细胞的生长状态，记录细胞生长、增殖、分化的过程。
4. 细胞传代：待细胞铺满培养皿底部时，用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于新的培养皿中，重复上述步骤。
五、实验结果1. 细胞复苏：复苏后的细胞在显微镜下观察到细胞呈圆形，细胞质清晰，细胞核明显。
2. 细胞生长：细胞接种后，在培养箱中培养，细胞逐渐铺满培养皿底部。
细胞生长过程中，细胞体积逐渐增大，细胞核逐渐增多。
3. 细胞增殖：细胞生长过程中，细胞数量逐渐增多，细胞铺满培养皿底部的时间逐渐缩短。
4. 细胞分化：在培养过程中，部分细胞发生分化，形成不同形态的细胞。
如神经细胞、肌肉细胞等。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，温度、CO2浓度、培养基成分等条件对细胞生长、增殖、分化具有重要影响。
实验中应严格控制这些条件，以确保细胞正常生长。
2. 细胞传代过程中，应注意防止污染。
操作应在超净工作台中进行，使用无菌器材，避免细菌、真菌等微生物污染。
3. 细胞培养实验过程中，应定期观察细胞生长状态，及时调整实验条件，以保证细胞正常生长。
动物细胞培养和核移植技术(讲课)
如何界定原代培养和传代培养； 如何界定原代培养和传代培养；细 胞株和细胞系？ 胞株和细胞系？
细胞株 细胞系
细胞 悬浮 液
10代 10代 细胞
原代培养
50代 50代 细胞
传代培养
无限传 代
胰蛋白酶除了可 消化细胞间的蛋 白质外， 白质外，长时间 作用也会消化细 胞膜蛋白， 胞膜蛋白，对细 胞有损伤作用， 胞有损伤作用 一般而言， 一般而言，10 ， 因此必须控制好 代以内能保持 增殖会逐渐缓慢， 增殖会逐渐缓慢， 胰蛋白酶的消化 正常二倍体的 原代培养 以至于完全停止， 以至于完全停止， 时间。 时间 核型 。 这时部分细胞的 细胞核可能会发 生变化， 生变化， 传代培养
营养（培养基成分） 2、添加一定量的抗生素 ） 营养（培养基成分
培养基的不同是 适宜的温度和PH PH值 3、适宜的温度和PH值 动物细胞培养和 植物组织培养最 4、36.5 +0.5度 必要的气体条件 O2和CO2 度 重要的区别
PH为7.2-7.4 为
CO2的主要作用是维持培养液的PH 的主要作用是维持培养液的PH
1.动物细胞核移植的概念、种类： 1.动物细胞核移植的概念、种类： 动物细胞核移植的概念
概念： 概念：
将动物的一个细胞核， 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核 的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎， 的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎， 这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物） 这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）
植物细胞和动物细胞培养的比较
比较项目 原理 培养基性质 培养基特有成分 培养结果 培养目的 植物组织培养 动物细胞培养
细胞的全能性 固体培养基 植物激素 植株 快速繁殖、 快速繁殖、培育 无病毒植株等
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。
而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。
细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。
根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。
如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。
M期完成遗传物质的分配。
因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。
二.培养细胞生命期（life span of culture cells）很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。
索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。
人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。
如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。
只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。
正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。
三.培养细胞一代生存期培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。
每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。
传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。
动物细胞的培养和生长技术
动物细胞的培养和生长技术，是生物学领域的一项重要技术。
它可以帮助生物学家更好地研究动物细胞的特性、生长过程和功能，从而为人们提供更好的医学支持和药物研发。
一、动物细胞的培养培养动物细胞需要选择合适的培养基和培养条件。
培养基是指一种能够满足细胞生长、分化和代谢等需要的营养液。
目前用于动物细胞培养的细胞培养基主要有两种，一种是定义培养基，另一种是复合培养基。
定义培养基是经过精确调配的，其中的各种元素和成分时不变的，能够精确控制细胞的生长与变化。
复合培养基则是将多种培养基成分混合在一起，适用于培养某些难以生长的细胞。
在选取培养基的时候，要考虑到细胞的来源和需求。
例如，不同种类的细胞需要的培养基成分可能有很大的不同，因此需要选择适合这种细胞生长的培养基。
二、动物细胞的生长动物细胞的生长是一个复杂的进程，需要合适的条件和环境。
在培养细胞的过程中，要注意控制以下几个方面：1、温度动物细胞生长的温度范围为37℃左右。
在培养细胞的过程中，需要控制好恒温箱的温度，以保证细胞的正常生长。
2、CO2在体内温度和CO2浓度相对稳定的情况下，细胞可以正常生长和分裂。
因此，在培养细胞的过程中，要控制好CO2浓度，一般设置为5%左右。
3、pH值动物细胞对pH值的适应范围比较窄，一般在7.2~7.4之间。
在培养细胞的过程中，要注意保持培养基的pH值，以避免对细胞生长产生不良影响。
4、细胞密度细胞密度是指每个培养皿中细胞的数量。
在培养细胞的过程中，要注意控制细胞密度的大小，避免出现超过存活数量以及空缺的情况。
三、动物细胞的常见培养技术1、单层培养单层培养是将细胞分散在培养皿表面上并逐渐生长成一层的技术。
这种技术适用于很多不同类型的细胞，如K562、HEK293等。
2、悬浮培养悬浮培养是将细胞在培养基中悬浮生长的技术，适用于一些不适合单层培养的细胞，如白细胞、淋巴细胞等。
3、三维培养三维培养是用一些支撑材料和培养基构建三维细胞组织的培养技术。
动物细胞培养
（2）消化分离法
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用 生化和化学手段进一步分散组织的方法。 1）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、 羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。 2）胶原酶（Collagenase）消化法： 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的消化 作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。上皮 细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的 消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果 甚好。
移液器
离心机
酶标仪
微孔板震荡器
液氮罐
（二）动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度: 37 ℃
2、pH：最适为7.2～7.4
3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。
（1）血清：
主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、
每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：
1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基 性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。
动物细胞体外培养
Animal cells cultured in vitro
一、基本概念
动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外 模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一 定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结 构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、 组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、
动物细胞培养的基本技术
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低温保护剂的应用
• 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 • 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可
迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外 形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
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细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计
数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和
上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色， 镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液 的加倍稀释作用。
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• 2．四唑盐（MTT）比色法
• 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； • MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫
•
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生
大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞
器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形
成大冰晶，即冰晶的重结晶。
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慢冻程序
• 标准程序： • 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min • 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min • 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 • 简易程序： • 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过
2.2.1动物细胞培养和核移植技术 课件
4、动物细胞培养技术应用
（1）、大规模培养生产生物制品（病 毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） （2）、作为基因工程中的受体细胞 （3）、培养的动物细胞可以用于检测 有毒物质，判断某种物质的毒性 （4）、为治疗和预防癌症及其他疾病 提供理论依据
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？
利用动物体细胞核移植技术
二、动物体细胞核移植技术 和克隆动物
1、动物核移植：
动物核移植是将动物的一个细胞 的细胞核，移入一个已经去掉细胞 核的卵母细胞中,使其重组并发育成 一个新的胚胎，这个新的胚胎最终 发育为动物个体。
克隆动物 用核移植方法得到的动物
供体细胞 （供核）
这些组织或器官 上的细胞生命力 旺盛，分裂能力强
动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官
胰蛋白酶
单个细胞
加培养液
细胞悬浮液 细胞贴壁生长 原代培养 10代细胞 接触抑制
遗传物质 未改变
细胞株
50代细胞
遗传物质 已改变
传代培养
细胞系 无限传代
有关概念:
原代培养：指将要培养的动物细胞取 出后,先用胰蛋白酶等使组织分散成 单个细胞,然后配制成一定浓度的细 胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶 中培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取 出，配制成细胞悬浮液，分装到两个 或两个以上的培养瓶中继续培养，称 为传代培养。
知识结构
动物细 胞培养 和核移 植技术
动物细胞培养 动物体 细胞核 移植技 术和克 隆动物
核移植技术和克隆动物的概念 体细胞核移植技术的过程 体细胞核移植技术的应用前景 体细胞核移植技术存在的问题
核移植技术
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动物细胞培养基本方法
二 细胞计数 1 血球计数板计数 2 自动细胞计数器计数 3 结晶紫染色细胞核计数法 4 MTT染色计数法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
包埋法 缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳
基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚 物网络内部。 一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。 常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶
动物细胞培养基本方法
已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫 疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红 细胞生成素、单克隆抗体等产品。
动物细胞培养基本方法
依细胞种类：原代培养、传代培养 依培养基：液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅拌
培养、微载体培养、中空纤维培养、固定 床或流化床培养。 生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。
用灌流培养，细胞密度低。
动物细胞培养基本方法
2、贴壁培养
必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培 养方法。 适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁 细胞。 基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。 对微载体而言还要求具有一定电荷密度。
动物细胞培养基本方法
优点：
a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养 液。 b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度 的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。 c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
动物细胞培养基本方法
一、动物细胞大规模培养的方法
1、悬浮培养（suspension culture） 让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。 适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂
交瘤 设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反
应器。 生产药物：单克隆抗体；干扰素。
动物细胞培养基本方法
优点：操作简单，培养条件均一，传质和传 氧效果好，容易大规模培养。借鉴微生物发 酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。 缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采
第五节 动物细胞培养的基本方法
一 细胞分离
1 离心分离法
用于从含有细胞的体液如血液、羊水、 胸腹水中分离细胞。一般用800～ 1000rpm离心5～10min。
动物细胞培养基本方法
2 消化分离法
先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液 将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液 洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。
④ 终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养 基。
动物细胞培养基本方法
⑤ 已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过 2～3次。
⑥ 2倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。 ⑦ 分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分
种以20～30万个/ml,每次1传2或1传3。 ⑧ 传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天就要传
动物细胞培养基本方法
②包埋或微囊培养： 将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。 可用于包பைடு நூலகம்细胞的载体材料为：人工合成的
高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如 胶原、纤维蛋白等。
动物细胞培养基本方法
包埋法： 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞 的方法。
优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细 胞泄露少，抗机械剪切。
2 细胞的复苏
➢ 复温速率 ➢ 复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。 一般来说复苏速度越快越好。 ➢ 常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内
完成复温。
动物细胞培养基本方法
第六节 动物细胞大量培养的方 法和操作方式
动物细胞培养基本方法
动物细胞大规模培养： 在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
理想的微载体应具备： 生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当
（1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在60250m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐 高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原 料充分。
80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球， 增大了供细胞贴附的比表面积。 应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原
三 细胞传代 1 悬浮细胞的传代
加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或 多只培养瓶即可。
动物细胞培养基本方法
2 贴壁细胞的传代
① 消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细 胞有无污染；
② 加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为 度；
③ 消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min, 当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。
代一次。
动物细胞培养基本方法
四 细胞的冻存和复苏 1 细胞的冻存
将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰 冻保护剂（二甲基亚砜+山梨醇+甘油+蔗糖）。 密封试管，继续在冰浴中停留15min。然后试管 以1℃/min的速度冷却，降到-40℃，在-40℃停 留2h后投入液氮罐（-196℃）。
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养
将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。 ①微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大
的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体 积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细 胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培 养的一切优点。 载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。
动物细胞培养基本方法
缺点： a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够
的面积。 b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。 c不能有效地监控细胞的生长。
贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载 体培养。
动物细胞培养基本方法
贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传 代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基 质上消化下来。
在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大 量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目 前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴 肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、 cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾 细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁 依赖)等。
动物细胞培养基本方法