金纳米粒子探针的合成及应用(一)

金纳米粒子探针的合成及应用(一)

作者：马立娜刘殿骏王振新

【摘要】由于金纳米粒子（AuNPs）具有与大小、形状和聚集程度相关的物理和化学特性，被广泛应用于各种生物分析和生物医学检测技术中，并发展成具有高选择性、高灵敏度的生物分析检测手段。以AuNPs为探针的分析方法通常具有简单、快速、灵敏度高的优点，并能应用于实际样品检测。本文综述了目前生物分子修饰的AuNPs探针的合成及其在检测金属离子、小分子、DNA、蛋白质和细胞内分析等方面的应用。

【关键词】金纳米粒子；探针；合成与修饰；评述

AbstractDuringlastdecade，goldnanoparticled(AuNPs)-basedassayshavebeenwell-developedandwidelyusedinbiologicalanalys isandbiomedicaldetectionbecauseAuNPshaveuniquephysicalandchemicalpropertieswhichdepend onthesize，shapeanddegreeofaggregation.TheAuNPs-basedassayshavealreadybeenemployedfordetectingpra cticalsampleswithhighsimplicityandselectivity.Thisreviewdiscussestherecentlydevelopmentofthes ynthesisandbiologicalmolecularfunctionalisationofAuNPsandtheirapplicationsontheheavymetallic cations，smallorganiccompounds，nucleicacidsandproteinsdetectionandcellularanalysis. KeywordsGoldnanoparticles；Probe；Synthesisandfunctionalization；Chemicalsensing；Review 1引言

纳米技术与化学、生物学、物理学和医学等领域的结合，对分析科学和生命科学领域的超灵敏检测和成像方法的发展起着越来越重要的作用1~5]。由于AuNPs具有独特的光学性质（表面等离子体吸收和共振光散射）、易进行表面修饰以及良好的生物相容性（通常认为裸AuNPs 是无生物毒性的，而修饰后的AuNPs的生物毒性由其配体决定），因此功能化AuNPs的应用领域不断被拓宽，特别是其在生物分析和生物医药等领域的应用引起了人们广泛关注2，3]。本文综述了生物分子修饰的AuNPs探针的合成及其在检测金属离子、小分子、DNA、蛋白质和细胞内分析等方面的新进展，以若干应用实例突显一些技术突破及发展趋势。

2金纳米粒子的合成、稳定性和功能化

2.1金纳米粒子的合成方法

金纳米粒子的制备方法可分为化学法和物理法。化学法是以金的化合物为原料，在还原反应生成金纳米粒子时控制粒子的生长，使其维持纳米尺度。化学合成法包括氧化还原法、电化学法、晶种法、模板法、微乳液法、微波合成法和光化学法等2]，其中最具代表性并被广泛应用的有：（1）Turkevich-Frens法6，7]，即在100℃下，通过改变还原剂（柠檬酸钠）和三价金的化合物（氯金酸或氯金酸钠）的比例来控制AuNPs粒径的大小，从而获得粒径在10~60nm范围内且分散性较好的AuNPs。该方法制备程序简单，且包裹在AuNPs表面的柠檬酸根容易被其它配体置换（如巯基修饰的DNA等）2，4]；（2）Brust-Schiffrin法8，9]，即在两相（液/液）体系或单相体系中，以四正辛基溴化铵（TOAB）为相转移剂，将三价金的化合物（氯金酸或氯金酸钠）转移到有机相中，以烷基硫醇为稳定剂，NaBH4为还原剂，制备粒径为1~8nm的AuNPs；硫醇/金盐的比例越大、加入还原剂速度越快，冷却溶液可以制得尺寸更小和单分散性更好的粒子，进一步通过配体交换反应改变AuNPs表面的配体而实现其功能化；（3）聚合物保护法：通常以含有聚乙二醇、硫醇或硫醚基团的聚合物为配体，以NaBH4为还原剂，制备水溶性或具有疏水性的粒径小于10nm的AuNPs。聚合物稳定剂决定纳米粒子的溶解性；例如，文献10，11]采用硫醚或硫醇修饰的聚合物配体（烷基硫醚终端修饰的聚甲基丙烯酸等）一步法合成了具有高分散性的粒径小于5nm的AuNPs，粒子的大小和分散性可以通过改变聚合物的结构、浓度和配体上能与金属结合的基团个数来控制，并且可以将粒径为1.1~1.7nm的无荧光纳米粒子转变为荧光纳米粒子。

物理法是利用各种技术将块状固体金分散为金纳米粒子，包括真空沉积法、电分散法、激光消融法等12]。物理法容易控制AuNPs的形状并能获得图案化的AuNPs的阵列，但通常需要特殊的设备和技术，制备过程较复杂。

2.2金纳米粒子的稳定性和功能化

将不同的识别分子（如功能基团）修饰到AuNPs上，获得功能化纳米粒子（AuNPs探针），有助于拓宽AuNPs的应用范围，发展基于AuNPs的分析/检测方法。已有很多文献对金纳米粒子的功能化及应用进行了综述1~5，13]。在介质中保持单分散性和稳定性是AuNPs在实际应用中的关键。因此，人们不断寻找新型稳定剂和修饰方法以提高AuNPs的分散性。这些方法将有助于改善方法选择性和准确度，其中最具代表性的方法1]如图1所示。在生物分析中可以应用静电吸附法、共价偶联（AuS共价结合等）法和特异性识别法（抗体-抗原，生物素-亲和素，DNA杂交等）将生物分子修饰到AuNPs表面，合成AuNPs探针。

图1金纳米粒子探针合成示意图1]（略）

Fig.1Schematicrepresentationofformationofgoldnanoparticleprobes1]

CopyrightWiley-VCHVerlagGmbH&Co.KGaAandreproducedwithpermission.

将配体通过静电吸附作用固定在AuNPs表面的方法简单、省时3]，但是配体与AuNPs结合强度小，稳定性差。如果反应缓冲溶液中含有二硫苏糖醇（DDT，含有两个巯基、不带电的小分子，常用作蛋白保护剂）或在高盐缓冲溶液（一般用于DNA杂化实验）进行长时间的孵育时，表面不稳定的AuNPs探针很容易产生非特异性结合，从而降低了检测的选择性。

与静电吸附法相比，共价偶联的方法较复杂，需要进行更多的配体合成工作。但是，配体与AuNPs通过共价键结合稳定性好。在共价偶联中通常以Au-S共价结合获得AuNPs探针，这种方法必须使用含有S的配体，如硫醇或二硫化物修饰的DNA、多肽CALNN等1~5，13~15]，通过共价法获得的AuNPs探针可以承受很高的盐浓度（2mol/LNaCl），并在某种程度上可以抵抗二硫苏糖醇或带巯基或氨基的分子的攻击。特别是将具有双亲性的配体（有S端具有疏水性，另一端具有亲水性，如烷基硫醇修饰的聚乙二醇、多肽CALNN等）通过共价键法修饰到AuNPs上，在其表面形成疏水-亲水层，将极大提高AuNPs在水溶液中的稳定性。

利用某些生物分子之间的特异性识别，如，（1）链霉亲和素修饰的AuNPs可以结合生物素化的蛋白（如免疫球蛋白和血清蛋白）或寡聚核苷酸16]；（2）蛋白A修饰的AuNPs用于连结不同免疫球蛋白的Fc碎片17]；（3）糖修饰的AuNPs用于识别其相应的结合蛋白，也可以设计功能化的AuNPs探针。

3金纳米粒子探针的应用

3.1重金属离子检测

基于AuNPs的比色法已经被广泛应用于有毒重金属离子（Pb2+，Cd2+和Hg2+等）的检测18，19]，这种方法克服了传统方法中诸如使用有机溶剂、光敏感的染料分子，实验过程繁琐以及仪器操作复杂等缺点。Wang等19]研制出基于DNAzyme修饰的AuNPs比色传感器，可以快速、简单、实时及线性范围可调地检测Pb2+（见图2）。他们选择对Pb2+有高特异性识别的DNAzyme，DNAzyme由底物链和识别链组成。底物链5＇末端和识别链3＇末端分别连有8个互补碱基做为延长链，两个互补碱基链可以使底物链和识别链在特定的温度下稳定杂交，同时也能够保证在Pb2+存在时，后者将DNAzyme另一端分裂后释放出单链DNA(ssDNA)。该体系在Tris和NaCl调节离子强度后加入AuNPs，当Pb2+存在时，Pb2+作用于DNAzyme 的识别位点将ssDNA释放出来并与AuNPs结合，阻止后者聚集，而使溶液呈现纳米金单分散状态的红色。没有Pb2+或有其它金属离子存在时，不发生分裂反应，加入的AuNPs无ssDNA 保护而发生聚集，溶液变为蓝紫色。这种传感器对Pb2+的检出限为3nmol/L，远远低于美国环境保护局（EPA）对饮用水中Pb2+浓度的检出限18，19]。Li等20]报道了另一种基于DNA 修饰的AuNPs探针检测Hg2+的比色方法，这种方法灵敏度更高，检出限可达1nmol/L。Xue21]