第五章透射电子显微镜生物样品制备技术..

二、固定
用物理或化学的方法迅速杀死细胞的过 程叫固定。 1、固定的目的：保存细胞的精细结构，防止 组织细胞的自溶；保护样品使其组成物质在以 后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失， 并使组织适度硬化，防止切片的变形。 2、固定的方法：有物理固定法和化学固定法。 1）、物理固定法：用高温、冷冻、干燥等物 理手段，使细胞结构固定，一般不用。 2）、化学固定法：用化学物质对细胞结构进 行固定，是常用的方法。
2）、缓冲液和固定液的配制 （1）、缓冲液的配制 在电镜样品制备中。常用的有磷酸和二甲 砷酸钠两种缓冲液。 A、 0.2mol磷酸缓冲液的配制 甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠（含2个水分子） 36.61g (含7个水分子） 53.65g （含12个是分子） 71.64g 加双蒸水至 1000ml
2、取材的注意事项
1）、取材的全过程要求在冷（40C ）的环境 中进行，所用的液体要提前进行预冷。 2）、切割样品时要采取一刀切开的方法，不 能用拉锯式切割法，尽量减少对样品的机械 损伤。 3）、样品的块要小，要求是1个立方毫米。 这样可使样品在较短的时间内得到充分的固 定。 4）、如果所取样品的表面有污染物，动物材 料要用冷的生理盐水洗；植物材料可用无离 子水或自来水洗，但清洗的时间一定要短。
第一节 透射电子显微镜 生物样品的 超薄切片制备技术
透射电镜的样品制备技术，主要有超薄切 片技术、负染色技术和冷冻蚀刻复型技术。
超 薄切片样品制作技术，是透射电镜生物医学样品 制备的最常用技术，其制作程序和石蜡切片的方法 步骤基本相同，但是在所使用的某些化学试剂及切 片机是完全不同的，对各技术步骤的操作要求要比 石蜡切片严格很多。一个能满足透射电镜观察要求 的超薄切片应具备以下几点： 1、切片厚度均匀，厚度在50～70nm. 2、切片无划痕、无震颤、无人工污染。 3、耐高真空，在真空中不变形、不升华。 4、耐电子束的轰击。
不同PH的0.2M 的磷酸缓冲液的配制
B、 二甲砷酸钠缓冲液的配制
甲液：二甲砷酸钠 加双蒸水至 4.28g 100ml
乙液：0.2N的盐酸。 按下表混合得不同PH值的缓冲液 PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液(ml) 50 50 50 50 50 50 乙液(ml) 18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7 （2）、固定液的配制 A、 0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液
三、清洗与脱水
1、清洗：在超薄切片制备技术中，清洗主要是指：
当用两种化学性质完全不同的固定液对同一样品进行 固定时，前一种固定液固定结束，一定要进行彻底清 洗后，才能用另一种固定液进行固定。如戊二醛和锇 酸双重固定，用戊二醛固定结束，必须用与配制戊二 醛所用的相同浓度和相同PH值的缓冲液彻底清洗后， 再用锇酸固定。否则会发生不良反应，对样品造成不 良影响，甚至损伤样品，使实验失败；再就是用锇酸 固定结束，要用双蒸水彻底清洗后，才能进行脱水。 清洗的时间一般不少于2小时，中间要换几次新清 洗液。
3、脱水时的注意事项 （1）、整个脱水过程应在较冷的环境中进行 （要求4摄氏度）。 （2）、在更换液体的过程中一定要避免样品的 自然干燥。 （3）、当进入高浓度的脱水剂时，要及时盖好 容器的盖子，防止空气中的水分进入脱水剂， 也要避免低浓度的脱水剂过多的带入高浓度 的脱水剂中。 （4）、脱水一定要彻底、干净。否则，会造成 包埋剂不能渗透到组织细胞的每个部位，使 制片失败。
如果材料漂在液体上面，需抽气让组织沉到 液体的底部，以便使组织得到充分的固定 游离细胞的取材：悬液培养的细胞需要离心 获得细胞的沉淀物，然后再用预冷的固定液 进行固定处理；贴壁培养的细胞要先想办法 收集细胞团再进行固定处理。 细菌的取材：取材方法基本和培养细胞的方， 法相同。悬液培养的要离心获得细菌沉淀物 进行固定，平板和斜面培养的可直接获得菌 团进行固定。 人体病理组织的取材：需提前做好准备，到 手术室取材。
（1）包埋剂的种类及配方
A、包埋剂的选择条件：包埋剂的选择在超薄切片样品 制备中很关键，因为它是渗入到组织的各个部位，固 化后起支撑作用。如果选择的包埋剂不合适，在固化 后会出现空泡或硬度和组织的硬度有差别，这样就起 不到很好的支撑作用，甚至会使切片失败。一种优良 的包埋剂应具备：包埋剂单体的粘度低，这样可便于 向组织内渗透；固化后收缩率小，可降低对组织的收 缩损伤；耐电子束轰击；在高真空中不便形、不升华； 固化后有良好的切削性能。 B、包埋剂的种类：根据上述选择条件，可用于制作超 薄切片的包埋剂有三种：甲基丙烯酸酯类；聚脂树脂 类和环氧树脂类。常用的是环氧树脂（EPON812）， 它是从国外进口的，它是一种塑料单体，为淡黄色的 粘稠的液体。
2、脱水：用脱水剂逐渐取代掉组织中水分的 过程叫脱水。 常用的脱水剂有酒精、丙酮。因丙酮对组 织内的物质有抽提作用，因此，在制作超薄切 片时，组织的脱水都用酒精，很少用丙酮。 脱水是采用逐渐提高脱水剂浓度的方法对 样品进行逐级脱水。脱水剂设置的浓度级差一 般有：50％、70％、80％、90％、100％（2 次）。在每级中脱水的时间据材料的质地不同 有一定变化，动物组织一般每级20分钟；植物 样品应加长脱水的时间。对一些含水多，柔软 的样品，应适当增加脱水剂的浓度级差，可从 30％开始脱水。
由于戊二醛是还原剂，锇酸是氧化剂。所以， 如果对同一样品进行戊二醛和锇酸双固定时，戊 二醛固定结束，一定要用与配制戊二醛相同浓度 和PH值的缓冲液彻底清洗后（清洗的时间一般 在2小时以上），才能再用锇酸固定。 锇酸的使用浓度是1％（用0.2M 缓冲液等比 例稀释储存液）的水溶液，在本液中固定的时间 不能太长，一般是1.5~2小时。锇酸固定结束， 一般用双蒸水清洗样品，直到把锇酸清洗干净。 整个固定和清洗时间都应在40C环境中进行（是 为了避免液体体积发生变化，造成对组织微细结 构的损伤）。
乙液：0.2M磷酸二氢钠溶液
磷酸二氢钠（含1个水分子）
(含2个水分子）
27.60g
31.21g
加双蒸水至
PH 甲液(ml) 乙液(ml) 6.4 13.3 36.7 6.6 18.8 31.2 6.8 24.5 25.5 7.0 30.5 19.5
1000ml
7.2 36.0 14.0 7.4 40.5 9.5
戊二醛最终浓度（％） 0.2M二甲砷酸钠缓冲液（ml) 25%戊二醛水溶液(ml) 双蒸水加至(ml) 1.0 50 4 100 1.5 2.0 2.5 50 50 50 6 8 10 100 100 100 3.0 50 12 100
对生物样品的固定，戊二醛的常用浓度是2.5％ ， 有时为了加快固定的速度，也常用3.0％的。使用的量 一般是样品总体积的10～20倍，对大多数样品固定的时 间是12小时以上 ，也可在本固定液中把样品保存一段 时间，但不能太长。 C、2%锇酸储存液的配制 锇酸一般是0.5克为一个包装，在使用时大多数情况 下，先配制成2%的水溶液储存，用时再加等量的0.2M的 缓冲液配成1%的使用。
根据上述要求，制作一个合格的超薄切 片需要经过以下步骤：取材、固定（双固
定）、清洗、脱水、置换、浸透、包埋、 聚合、修块、超薄切片、捞片、电子染 色。
由于透射电镜是观察研究组织或细胞内 的超微结构，也就是主要研究细胞器的内部 结构，它对观察样品的要求十分严格。所以 在样品的制备过程中一定要慎重的对待每一 操作步骤，否则会造成实验结果的失败。因 为有很多材料不能重复取材（如人的病理组 织），所以一旦结果不好或失败， 是不可彌补的。
PH为4.0～5.0 。它的穿透能力很强，是蛋白 质的优良交联剂，对细胞膜系统、细胞骨架、 糖元、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。 但不能保存脂类物质，不能有效地提高样品 的电子反差。 （2）、锇酸 是一种强氧化剂，分子量为 254.2，水溶液为中性。它对脂类物质固定效 果很好，对核蛋白、蛋白质都有较好的固定 效果，能有效地提高样品的电子反差。但不 能保存糖类物质，对人体的粘膜组织刺激很 强，毒性大。用时一定要在通风条件好的环 境中进行。
戊二醛的最终浓度（％） 0.2M磷酸缓冲液(ml) 25％戊二醛水溶液(ml) 双蒸水加至(ml) 1.0 50 4 100 1.5 50 6 100 2.0 2.5 50 50 8 10 100 100 3.0 50 12 100 4.0 50 16 100 5.0 50 20 100
B、 0.1M二甲砷酸钠缓冲戊二醛固定液
化学固定又可分为： （1）、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定， 这种方法只是在一些特殊要求的样品制备中使用（如电 镜细胞化学样品制备时），常规制样一般不使用。 （2）、双重固定法。用两种或两种以上的性质不同的固 定剂对同一种样品进行固定，这种方法是最常选用的。 它可以相互彌补固定剂各自的不足，使细胞内的各种结 构都得到充分的固定。 （3）、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中 使用的方法，可以防止细胞的自溶。 （4）、灌流固定法。也是在动物组织取材时选用的一种 临时固定方法，从动脉向组织内灌注固定液，使组织在 短时间内得到充分的固定，本方法适用于独立性好的器 官取材时的的临时固定。
一、取材
从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫 取材。 1、取材的方法 动物和植物的取材方法稍有不同。 动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动 物，然后要在尽短的时间内（要求在１分钟之 内）把所需要的组织取出放入预冷（ 40C ）的 固定液中，稍加固定后再切成适当大小的块(要 求１立方毫米大小）； 植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大 小的块，放入预冷的固定液中，
四、浸透与包埋
1、置换：由于脱水剂酒精不能与包埋剂互溶， 所以在浸透之前必须用既能和脱水剂互溶又能与 包埋剂互溶的溶剂对经过脱水的样品进行处理 （即置换），以便包埋剂渗透到组织细胞的各部 位中。常用的置换剂是环氧丙烷。置换的方法 是逐渐提高置换剂的浓度，使样品最后进入纯置 换剂中，一般用纯酒精和环氧丙烷等量混合液处 理样品20～30分钟，再用纯环氧丙烷处理30分钟。 即可进行包埋剂的浸透处理。 2、浸透：用包埋剂逐渐取代组织中的置换剂并 渗透到细胞的各个部位的过程叫浸透。