分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因_赵丽华.caj

志贺菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）细菌通称痢疾杆菌，在我国感染性腹泻病原菌中居首位，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰阴性肠道致病菌，每年全球有１．６亿人患病，约有１１０万人死亡，绝大多数为５岁以下儿童［１］。

抗生素的大量使用，导致Ｓｈｉｇｅｌｌａ耐药菌株不断增加，使治疗越来越困难。因此，准确、快速的检验手段是对细菌性食物中毒病原菌进行有效、迅速的预防和控制的迫切需要。

传统的检测方法费时、费力，近年来，随着微生物基因组学的发展，微生物基因检测迎来了新的机遇。１９９６年，由ＴＹＡＧＩ等［２］首次建立一种新型分子信标荧光探针技术，其特异性好、灵敏度高。目前，尚无Ｓｈｉｇｅｌｌａ分子信标探针应用的研究。本研究试图将分子信标探针技术应用于

Ｓｈｉｇｅｌｌａ的检测。

１

材料与方法

１．１

菌株与试剂１．１．１

样本来源

福氏志贺菌（２αＴ３２）１株、

痢疾志贺菌（４８０９７）１株、

宋氏志贺菌（５１２８３）１株、大肠杆菌（８０９９）１株、肠炎沙门菌（５００４１）１株、金黄色葡萄球菌（６５３８）１株、

Ｔｏｐ１０大肠杆菌１株，由本系保存；福氏志贺菌（５０７０５６）２

株、鲍氏志贺菌（２２０５０）１株、宋氏志贺菌（０５０１２）１株，由南方医院检验科惠赠；福氏志贺菌（临床分离株）３株、宋氏志贺菌（临床分离株）２株，由广州市疾病预防控制中心惠赠；福氏志贺菌（临床分离株）２株、痢疾志贺菌（临床分离株）１株、链球菌（临床分离株）１株，由广东省武警总队医院检验科惠赠；鲍氏志贺菌（５１５８２）购于中国药品生物制品检定所；８种细菌共２１株。细菌的分离与培养均按照卫生部颁布《全国临床检验操作规程》

进行［２］。１．１．２试剂ｐＧＥＭ－Ｔ载体克隆系统为Ｐｒｏｍａｇｅ产品；

ＰＣＲ产物纯化试剂盒为北京赛百盛基因有限公司产品；质

粒快速提取试剂盒为北京鼎国生物技术有限公司提供；

分子信标ＰＣＲ检测志贺菌ｉｐａＨ基因

赵丽华，周

勇，万成松＊

（南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系，广州５１０５１５）

【摘要】目的

用分子信标探针ＰＣＲ快速检测志贺菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）。方法

根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的福氏志

贺菌Ｍ３２０６３株ｉｐａＨ基因序列，设计引物和分子信标探针，以４种细菌进行对照，进行特异性和灵敏度分析，建立Ｓｈｉｇｅｌｌａ的实时ＰＣＲ技术快速检测，应用于食物中毒和食品检测。结果检测２０个样本，Ｓｈｉｇｅｌｌａ呈阳性，其

它呈阴性，时间约２ｈ。结论

Ｓｈｉｇｅｌｌａ分子信标探针技术具有快速、

灵敏度高、特异性强等特点，可用于Ｓｈｉｇｅｌｌａ食物中毒快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。

【关键词】Ｓｈｉｇｅｌｌａ；分子信标；实时ＰＣＲ；ｉｐａＨ中图分类号：Ｒ３７８．２５

文献标识码：Ａ

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｈｉｇｅｌｌａＧｅｎｅｉｐａＨＵｓｉｎｇＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎｓ

ＺＨＡＯＬｉ－ｈｕａ，ＺＨＯＵＹｏｎｇ，ＷＡＮＣｈｅｎｇ－ｓｏｎｇ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈａｎｄＴｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｃｈｉｎａ）

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｈｉｇｅｌｌａｇｅｎｅｉｐａＨ．ＭｅｔｈｏｄｓＰｒｉｍｅｒｓａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｏｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｉｐａＨ

ｇｅｎｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋ．

Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．２０ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ．

Ｒｅｓｕｌｔｓ

Ａｌｌ

Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｉｎｔｗｏｈｏｕｒｓ．

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ

Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｂｅａｃｏｎ－ｂａｓｅｄｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｉｓａｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆＳｈｉｇｅｌｌａｉｎｆｏｏｄｓ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｓｈｉｇｅｌｌａ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ；ｉｐａＨ

基金项目：广东省科技计划项目（Ｎｏ．２００２Ｂ３１００１０１）。作者简介：赵丽华（１９７９～），女，硕士研究生。

＊

通讯作者：万成松，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｚｗｃｓ＠ｆｉｍｍｕ．ｃｏｍ

・论著・

［文章编号］１６７２－３６１９（２００６）０５－０４９９－０４

Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ分别购自宝生物工程有限公司。

１．２仪器

ＰＣＲ仪为Ｂｉｏｍｅｔｒｏ公司产品；凝胶成像分析系统ＵＶＩｔｅｃ为英国产品；Ｍ７５０－Ｂ型多功能紫外分光光度计、ＤＡ６２０Ｓ微量荧光检测器为上海棱光技术有限公司产品；ＦＴＣ２０００荧光定量ＰＣＲ仪为上海枫岭生物技术有限公司产品。

１．３引物及探针

根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的福氏志贺菌Ｍ３２０６３株ｉｐａＨ基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计ＰＣＲ引物及分子信标探针，探针为两引物间的一段寡核苷酸，５′端标记６－羧基荧光素（ＦＡＭ），３′端标记４－［４′－二甲基胺基苯基氮］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）。引物和探针分别由上海博亚生物技术有限公司和上海闪晶生物技术有限公司合成，序列见表１。

１．４样品模板制备

细菌在普通肉汤培养基中培养过夜，取５０μｌ细菌培养液移至１．５ｍｌ离心管，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，加入５０μｌ裂解液，３７℃放置１０ｍｉｎ，再加入１００μｌ三蒸水，煮沸１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清５μｌ直接用于ＰＣＲ扩增。阴性对照（大肠杆菌８０９９１株、肠炎沙门菌５００４１１株、金黄色葡萄球菌６５３８）和阳性对照（福氏志贺菌２αＴ３２、痢疾志贺菌４８０９７、宋氏志贺菌５１２８３）均按照上述方法处理。

１．５临床标本的处理

收集临床腹泻患者粪便标本２０份，取约黄豆大小的可疑粪便于０．５ｍｌＰＢＳ（０．１ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７．４）中，漩涡混匀，取上层至另一离心管中，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，洗涤１次，加入１００μｌ裂解液，漩涡混匀，１００℃煮沸１０ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。取上清液５μｌ加入５０μｌ的ＰＣＲ反应液中。

１．６阳性标准品的构建

以福氏２ａ志贺菌（２αＴ３２）株作为标准参考菌株，抽提ＤＮＡ后作为模板，按常规方法用引物ｉｐａＨ１和ｉｐａＨ２进行ＰＣＲ扩增，将纯化后的扩增产物克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体，转化Ｔｏｐ１０感受态细胞，涂抹Ａｍｐ＋／ＩＰＴＧ／Ｘ－ｇａｌ平板上，３７℃培养１２～１６ｈ，进行蓝白斑筛选，挑白斑，增殖，提取质粒，获得的阳性克隆菌经ＰＣＲ初步鉴定后，由ＴａＫａＲａ公司测序。鉴定后制成阳性标准品，－２０℃分装保存。１．７ＰＣＲ扩增体系

５０μｌ反应体系中含１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２）５μｌ、１．２５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ４μｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ引物各０．３μｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶（３Ｕ／μｌ）０．３μｌ、探针０．３μｌ，模板上清液５μｌ，三蒸水３４．８μｌ。每次实验均包括空白对照（模板ＤＮＡ由无菌水取代）、阴性对照（大肠杆菌８０９９１株、肠炎沙门菌５００４１１株、金黄色葡萄球菌６５３８）、阳性对照（福氏志贺菌２αＴ３２、痢疾志贺菌４８０９７、宋氏志贺菌５１２８３）。循环条件：９４℃预变性１０ｍｉｎ，９４℃１ｍｉｎ、５５℃１ｍｉｎ、７２℃６５ｓ，共３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。

１．８标准曲线

将鉴定好的质粒测Ａ值，计算出原始拷贝数，按１０倍数连续稀释，加入５０μｌ反应体系，在ＦＴＣ２０００荧光定量ＰＣＲ仪上进行扩增。取中间数量级１．０×１０８ｃｏｐｙ／ｍｌ～１．０×１０５ｃｏｐｙ／ｍｌ作为模板，在ＦＴＣ２０００荧光定量ＰＣＲ仪进行扩增并实时检测。

２结果

２．１凝胶琼脂电泳结果

用福氏志贺菌、痢疾志贺菌、宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌及大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的ＤＮＡ用引物ｉｐａＨ３、ｉｐａＨ４进行常规ＰＣＲ反应。电泳结果显示，４株Ｓｈｉｇｅｌｌａ有一条１５０ｂｐ的扩增产物，扩增出特异的、与预期结果相符的ＤＮＡ片段，未见非特异性扩增带，而４株阴性对照菌株未扩增出ＤＮＡ条带（图１）。

２．２灵敏度分析

选福氏２ａ志贺菌克隆质粒作为模板进行ＤＮＡ灵敏度分析，用紫外分光光度计测ＤＮＡ浓度。用ｄｄＨ

２

Ｏ进行１０倍连续稀释，２％琼脂糖凝胶电泳可检测至１０４ｃｏｐｙ／ｍｌ的样品，ＲＴ－ＰＣＲ可检测至１０２ｃｏｐｙ／ｍｌ的样品，显示出更高的灵敏度（图２）。

２．３重组质粒拷贝数

重组质粒分子量＝（质粒分子量＋引物片段分子量）×常数＝（３０００＋５７１）×３２４．６＝１１５９１４６．６。重组质粒质量浓度＝

表１福氏志贺菌ｉｐａＨ基因引物和分子信标探针序列Ｔａｂ．１Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｐｒｏｂｅ

ＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉｉｐａＨｇｅｎｅ

引物名称ＰｒｉｍｅｒｉｐａＨ１ＰｒｉｍｅｒｉｐａＨ２ＰｒｉｍｅｒｉｐａＨ３ＰｒｉｍｅｒｉｐａＨ４Ｐｒｏｂｅ

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ５′－３′

５′－ＣＧＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＣＴＣ－３′

５′－ＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧ－３′

５′－ＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＡＡＧ－３′

５′－ＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ－３′

５′－ＦＡＭ－ＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＣＴＧ

ＣＣＧＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧ－ＤＡＢＣＹＬ－３′

序列位置（ｂｐ）

１２３６～１２５６

１８０６～１８２６

１４５２～１４７２

１６０２～１６２２

１５１２～１５３４

图１８种细菌ＰＣＲ电泳图

Ｆｉｇ．１ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｉｇｈｔ

ｓｔｒａｉｎｓ

１：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２：Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ２×Ｔ３２；３：Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｉ５１２８３；

４：Ｓｈｉｇｅｌｌａｂｏｙｄｉｉ５１５８２；５：Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ４８０９７；６：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ

ｃｏｌｉ８０９９；７：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ５００４１；８：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ

６５３８；９：

Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ．