生物固氮测定方法研究进展word

生物固氮测定方法研究进展
2016051848 黄鹏
摘要:对生物固氮测定的方法乙炔还原法(A R A)、15N同位素稀释法(I D)、、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法进行综述,并评述了其引起误差的因素和测定结果的准确性。

关键词:生物固氮;固氮量;测定;方法
目前,固氮测定技术对于生物固氮研究是十分重要的。

随着研究的深入,固氮
测定技术也不断地向准确、可靠、操作简便的方向发展。

生物固氮测定方法主要
有乙炔还原法、、15N同位素稀释法、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法等。

为便于更好研究生物固氮, 本文主要介绍常用的几种测定方法以及它们的优缺点,
以供参考。

1乙炔还原法
始于20世纪60 年代, 目前被广泛应用,根据固氮酶具有还原分子氮或利用其他底物的能力,使乙炔还原为乙烯,作为固氮的间接测定。

从植物根际分离的
纯培养物分别接种于盛有无氮半固体培养基的血清小瓶中,置于28 ～30 ℃培养箱中培养48 h ,将血清小瓶瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞,用无菌注射器抽出10 %的气体, 每瓶注1 mL C2H4,,再置于28 ～30 ℃下培养24 ～48 h。

用无菌注射器从瓶种抽取混合气体0 .2 m L 注入气相色谱仪(GC)进样柱中, 测定C2H4含量。

其中,以不接种菌注有C2H2的血清小瓶为对照, 重复 3 次。

从显示屏上C2H2、C2H4峰值判定有无C2H4的产生以确定其固氮性能, 按下式计算其固氮酶活性大小。

A RA =（实际C2H4峰面积×标准气含量×血清小瓶容积∕（标准气峰面积×进样量×培养时间×样品量）。

主要仪器：SP一02型气相色谱仪和氢离子化鉴定器。

该方法优点是灵敏度高,操作较简单,速度快、费用较低,可快速确认固氮作
用的存在与否。

并通过还原乙炔活性的强弱，推算出植物——— 固氮菌联合体
的固氮量、适应范围广,可以离体,也可以整株活体连续测定或原位测定。

缺点是不能直接而准确的获得生物固氮量,不适于长时期田间共生固氮的定
量测定,只能短时间内测定固氮酶活性动态,长时间测定时必须考虑到周围环境的影响。

在理论上可以用C2H2与H 比为3 ∶1换算固氮结果,实际上已报道的有1 .5∶1 .0～25∶1 .0 的各种比例。

尤其对田间系统更复杂，因此, 要在控制
条件下测定或在田间单因子条件下测定,以便进行校正，准确性差、结果可靠性不强。

215N 同位素稀释法
ID 的原理是将固氮系统暴露在15N中，经一定时间后，如果在该系统中发
现了15N H 3或其衍生物，则可判定发生了固氮作用, 15N
氮研究中确认菌株有无固氮能力最直接最可靠的方法。

并且适用于自然田间原位或施入某种固氮菌剂后的作物根际联合固氮量的测定，是确定固氮作用定性和定量的最标准方法。

不需校正因子，并可以校正定氮的一些技术操作。

该方法被认为是最有效而实用的方法。

固氮植物和非固氮植物(作为参考植物)生长在施用相同量15N标记肥料的土壤中,如果两种植物从土壤和肥料中吸收相同比例的N素，在没有其他N素来源的情况下,两种植物体内应有相同的15N/14N组成。

当豆科植物固氮时,由于利用了空气中没有标记的N素，植物体内15N浓度将被稀释,15N/14N比例下降,而参考植物的比例不会发生变化,从空气中固定的N素占豆科植物全部N 素的比例(%N df a)可通过下式计算：
⁄)×100
%Ndfa=(1- %NdfF%NdfNF
其中%N dfF 为固氮植物体内15N的原子百分超;
%N dfNF为非固氮植物体内15N的原子百分超;
总固氮量=%N df a ×固氮植物体内全N 量。

ID 的优点是灵敏度高、准确度高可靠性强可以校正非直接测定法的准确性、也能够测定田间综合条件下的固氮量,而且能够区分来源于空气、土壤、肥料中的N 素量,在选育高固N 能力的品种试验中只需要比较固N植物体内15N的含量不需要参考植物的数据。

能够确定某种细菌是否固氮，适合联合固氮菌固氮量的测定。

不需选择参考植物。

缺点是需要选择参考植物。

它会影响固N量的精确性,不会造成很大的测定偏差。

选取同一土壤库中吸收养分相似的根系类型，有相似的N 素吸收类型和生长速率。

15N价格昂贵，测定手段繁琐，易受大气和土壤中15N的干扰。

3非同位素法
通常，磷的含量是随着氮水平的增加而增加，在植物成熟期积累更多的磷。

接种微生物肥料磷的吸收显著增加。

这种方法是应用了全量、1/ 2 量、1/ 4量和
不施肥，其中以不接种为对照。

在植物成熟后，收集样本风干测定总产量，进行化学成分分析(全氮和全磷的含量), ARF 计算公式如下:
AFR=(NP-NP0)/NF
其中A RF :固氮百分数;N P :接种土壤植物吸收的全氮;,
NP0:非接种土壤植物吸收的全氮, ;N F :施氮水平。

非同位素的优点是简单、易行、不需要较精密的仪器、成本低;缺点是时间较长，需要测定全产,不能估计因减产而造成的试验误差, 因氮肥的施用量不同, 会影响测定结果。

高氮施肥水平导致作物从根、作物吸收的氮减少。

4 全氮量差法
全氮增加是固氮量测定可用全氮增加来衡量，在无化态氮来源情况下, 若生命系统中全氮量有净增加则表明有固氮作用发生。

全氮分析有两种基本方法, 凯尔道氏湿消化法和杜马氏干烧氧化法，比较固氮系统和不固氮系统中全氮量, 以确定固氮量。

固氮量计算为固氮系统全氮减去非固氮体系全氮。

总氮差值法=固氮作物总氮-对照作物的总氮。

5酰脲估测法
在开花初期和结荚初期,采鲜样测定幼茎段(包括叶柄)烘干磨碎后测定酰脲含量全氮含量(凯氏定氮法), 硝态氮含量氨态氮含量(茚三酮法);最后计算酰脲相对丰度:酰脲-N /(酰脲-N +硝态-N +氨态-N )× 100 %。

固氮酶活性与幼茎段酰脲含量及酰脲相对丰度均呈极显著正相关。

酰脲是氮素固定的代谢产物，因此，可以估测固氮量。

参考文献:
[1]姚拓,龙瑞军,王刚等,兰州地区盐碱地小麦根际联合固氮菌分离及部分特性研究[J].土壤学报,2004,41(3):444～448.
[2]东秀珠,蔡妙英,常用常见细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社.2001.
[3]黄东风,翁伯琦,罗涛.豆科植物固氮能力的主要测定方法比较[J].江西农业大学学报,2003,25:17～20.
[4]李先海,李新民,SethKADanso.应用15N稀释法筛选高固氮能力的大豆品种[J].核农学报,1998,12(5):299～303.
[5]陈明,姚允寅,张希忠.不同形态氮素对15N同位素稀释法估测苜蓿固氮的影响[J].核农学报,1997,18(1):30～33.
[6]姚拓,蒲小鹏,张德罡,等.高寒地区燕麦根际联合固氮菌研究Ⅲ固氮菌对燕麦生长的影响及其固氮量测定[J].草业学报,2004,13(5):101～105 .
[7]于百双.应15N同位素稀释法鉴定大豆新品系的固氮能力[J].核农学通报 ,1997,18(1):34 ～35.
[8]李玉中,RedmannRE,祝廷成,等.羊草草原豆科牧草生物固氮定量研究[J] .草地学报,2002,10(3):164～166.
[10]孙国庆,曹亚澄,施书莲,等.几种冬季固氮植物固氮量的评估[J].土壤, 1997,29(2):99～102.
[11]宋海星,申斯乐,马淑英,等.硝态氮和氨态氮对大豆根瘤菌的影响[J].大豆科学,1997,16(4):283～286.
[12]窦新田.生物固氮[M].北京:农业出版社,1989,17～19.。