2010版药典lowry法测定蛋白含量的方法
lowry法测蛋白浓度
Lowry法测蛋白浓度1. 引言蛋白质是生物体内的重要组成部分，对于研究生物学和生物化学具有重要的意义。
因此，准确测定蛋白质浓度是许多实验的基础和前提。
目前有多种方法可以用来测定蛋白质浓度，其中之一就是Lowry法。
Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，其基本原理是蛋白质在碱性溶液中与一种重铜离子（Cu2+）在碱性溶液中反应生成蓝色化合物。
这种化合物的浓度与蛋白质的浓度成正比，可以通过比色法测定其光密度来间接测定蛋白质的浓度。
本文将介绍Lowry法的实验步骤、操作注意事项以及分析结果的计算方法。
2. 实验步骤以下是使用Lowry法测定蛋白质浓度的基本步骤：2.1 样品制备首先，需要将待测样品制备成适合测定的形式。
一般来说，常用的样品可以是细胞裂解液、血清、纯化的蛋白溶液等。
如果样品中含有较高浓度的干扰物质（如胆固醇、脂肪酸等），需要进行预处理，如脱脂、去盐等步骤。
2.2 制备标准曲线为了确定蛋白质浓度与光密度之间的关系，需要制备一系列不同浓度的蛋白标准溶液。
可以选择纯化的标准蛋白或者BSA（Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白）作为标准溶液。
将标准溶液按照一定比例稀释，得到多个不同浓度的蛋白溶液。
2.3 操作步骤1.取相同体积的标准蛋白溶液和待测样品分别加入试管中。
2.加入适量的助溶剂，如醋酸和硫酸，使样品变为碱性溶液。
3.加入重铜离子试剂，使其与蛋白质反应生成蓝色化合物。
4.反应终止，可以加入另外一种试剂或者改变pH 值。
5.使用分光光度计测定蓝色化合物的吸光度（光密度）。
2.4 制备标准曲线和测定样品浓度根据实验所得的吸光度值，绘制出标准曲线。
在一张坐标纸上，纵坐标为吸光度，横坐标为标准溶液的蛋白质浓度。
通过连接各个点，得到标准曲线。
然后，使用同样的方法测定待测样品的吸光度值，并通过标准曲线来计算样品的蛋白质浓度。
3. 操作注意事项•实验过程中要注意安全，佩戴手套和实验服，避免接触有毒化学试剂。
Lowry氏法测定蛋白质含量
使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成 钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白 质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓 度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样 品中蛋白质含量。（还原反应）
操作步骤
1.取三支试管分两组，按下表操作
试管编号
01
2
牛血清白蛋白标准
-- 1.0 --
分光光度计使用前需预热，绝对调零和空白管调 --
--
待测蛋白质溶液(mL)
-- --
1.0
2. 各管加入试剂甲5ml混匀放置10分钟。 3.各管加入试剂乙0.5ml后立即混匀，37℃ 水浴30分钟后用500nm单色光比色测定。 4.计算 样品蛋白质含量（ug/ml）
结果与计算：
根据测定管光密度值计算血清蛋白质 含量，C测=A测*C标/C测
注意事项：
各管加酚试剂时必须快速，并立即摇匀，不应出现
混浊。
移液管使用前要看清楚刻度和是否写着快、吹，如
有则需要用洗耳球吹出剩余液体
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因
为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只 在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性 的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼 酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。
Lowry氏法测定蛋白质含量
The Lowry Method for Protein Quantitation
目的与要求：
掌握Lowry氏法测定蛋白质含量的
原理及方法；
掌握分光光度法
实验原理：
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯
合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反 应 Biuret Reaction）
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
蛋白质检测(Lowry)--方法学验证
Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
lowrry法检测蛋白质含量.
Lowry法测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定，可检测的最低蛋白质量达5μg，通常测定范围是20~250μg。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂（1）酚试剂（2）碱性铜溶液：摇匀，即得。
本液应临用配制。
标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用超纯水定量稀释至1mg/ml，作为贮备液。
精密量取贮备液1.0ml置10ml离心管中，用超纯水稀释至10ml，摇匀，即为100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
测定法准确量取超纯水1.0 ml，作空白对照。
精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，加超纯水至1.0 ml；精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，样品1α-IFN，分别取50ul和30ul，加超纯水至1.0 ml，稀释20倍和33.3倍；精密量取一定体积供试品2（含蛋白质50μg左右）置试管内，实验室样品2，分别取100ul和200ul，加超纯水至1.0 ml，稀释10倍和5倍；每管都加入碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟；快速加入酚试剂0.5ml，马上摇匀，室温放置8分钟，显色后，照紫外-见分光光度法，在波长650nm 处测定吸光度。
结果如下：以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
方程：y=0.0023x + 0.0261 R2 =0.9961样品1α-IFN：7号管，稀释20倍，OD值0.163，经计算x = 59.52μg/ml，样品蛋白浓度为1.190 mg/ml。
8号管，稀释33.3倍，OD值0.110，经计算x = 36.48μg/ml，样品蛋白浓度为1.216 mg/ml。
则样品1 α-IFN的蛋白浓度为1.203mg/ml。
Lowry法检测蛋白质含量
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
蛋白含量(Lowry法)测定标准操作规程
细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于细胞因子原液的检定。
目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。
原理：lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。
是由试剂A和试剂B二部分组成。
试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。
在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。
内容：1 材料1．1样品：经二人核对好批号后测定。
1．2试剂钨酸钠Na2WO4·2H2O 化学纯钼酸钠Na2M O O4·2H2O 分析纯磷酸H3PO4 分析纯浓盐酸HCl 分析纯硫酸锂Li2SO4 分析纯酒石酸钾钠C4H4O6KNa·4H2O 分析纯硫酸铜CuSO4 分析纯氢氧化钠NaOH 分析纯无水碳酸钠Na2CO3 分析纯溴水Br2 分析纯1．3标准品：由中国药品生物制品检定所提供。
1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．5其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。
1．6仪器、设备紫外分光光度仪,UV-265扭力天平，TN100B冰箱，BOD-170A1．7器皿试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。
2 方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。
2．1．2调试仪器设备2．1．2．1紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。
2．1．2．2扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。
2．1．2．3冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。
蛋白质定量(LOWRY法)
蛋白质定量/蛋白质含量的测定(LOWRY法)实验原理Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。
因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
实验试剂Na2WO4•2H2O；Na2MoO4•2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4•H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4•5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。
实验设备试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。
实验材料可溶性蛋白质实验步骤1. 酚试剂的制备（1）取Na2WO4•2H2O 100g，Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。
安上回流冷却装置（使用磨口接头。
用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入Li2SO4•H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。
冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。
滴定终点由蓝变灰。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生命体内重要的营养成分，对于人体健康和生物学研究具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质含量是很多领域的研究人员和实验室工作者所关注的问题。
本文将介绍蛋白质含量的测定方法及其原理，希望能为相关领域的研究工作提供一些帮助。
一、Lowry法。
Lowry法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是在碱性条件下，蛋白质与铜离子和碱性液体中的酚反应生成蓝色络合物，通过比色法测定蓝色产物的光密度来确定蛋白质的含量。
这种方法的优点是灵敏度高，适用于各种类型的蛋白质样品，但需要注意的是，在实际操作中需要严格控制试剂的浓度和反应时间，以确保测定结果的准确性。
二、Bradford法。
Bradford法是另一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料结合后，会导致染料的吸收峰发生位移，从而使得溶液的吸光度发生变化。
通过比色法测定吸光度的变化来确定蛋白质的含量。
这种方法的优点是操作简便，灵敏度高，适用于多种类型的蛋白质样品，但需要注意的是，不同蛋白质对染料的结合能力有所差异，因此在测定时需要选择合适的标准蛋白质来建立标准曲线，以确保测定结果的准确性。
三、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质的碱性氨基酸在碱性条件下发生还原反应的蛋白质含量测定方法。
其原理是在碱性条件下，蛋白质中的酚和醛基与铜离子和BCA试剂中的蛋白质发生还原反应生成紫色络合物，通过比色法测定紫色产物的光密度来确定蛋白质的含量。
这种方法的优点是对于一些干扰物质的耐受性较好，适用于多种类型的蛋白质样品，但需要注意的是，测定条件的严格控制对结果的准确性至关重要。
总结。
蛋白质含量的测定方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在选择测定方法时，需要根据样品的特点和实验条件来进行选择，并严格控制测定过程中的各项操作，以确保获得准确可靠的测定结果。
希望本文介绍的内容能够对相关领域的研究工作提供一些帮助，同时也希望研究人员能够根据实际情况选择合适的方法进行蛋白质含量的测定工作。
Lowry法和 Bradfard法测定蛋白质含量
Lowry 法和Bradfard法测定蛋白质含量一.试剂Folin酚试剂(甲) 70毫升Folin酚试剂(乙) 8毫升考马斯亮兰G250 70毫升BSA 10毫升二.实验材料血清 10 ml小白菜 2克(叶多梗少)三.实验仪器722分光光度计 ; 低速台式离心机;电热恒温水浴(37℃) ; 微型漩锅混合仪四.本次实验所需器皿洗涤普通试管 27只 0.5毫升移液管 2支离心试管4只 1毫升移液管 5支50毫升容量瓶 4只 5毫升移液管 2支￠7㎝布氏漏斗 1个研钵 1个150ml抽滤瓶 1个 50毫升烧杯 1个125毫升棕色试剂瓶 2个玻璃比色皿 1对说明:1.试剂乙加入后务必立即混合.2.血清与BSA在两种测定方法中浓度不同.用时从冰箱冷藏室取用.3.取试剂一律用本实验配给的专用干净量具,按给定取用量一次性取足,量具用毕放回原处,勿扯用.15ml以内试剂取用量可直接用自备试管(1.5×15)或具塞试管装取,其余用试剂瓶装取.4.实验材料一律用自来水、蒸馏水洗净,吸水纸吸干水分后再用称量纸称重.一般情况测定酶及RNA等材料都采用冰浴研磨.5.移液管、容量瓶用洗液洗涤.(洗瓶用毕倒回原瓶)其余用洗衣粉洗涤(务必用自来水反复冲洗十几遍后再用蒸馏水过一遍)6.使用所有仪器前必须清楚该仪器的正确使用方法及步骤,使用光度计时,自带洗瓶、废液杯(500ml塑料烧杯),并登记仪器使用情况.7.值日生负责本次实验工具取还,蒸馏水补充及实验室卫生.卫生要求:(1)所有实验台及公用台抹干净,地面拖干净.(2)检查所有仪器是否置正常关机位置.并拔出电源,盖好机罩.(3)垃圾倒干净,废液桶倒干净.。
Lowry法检测蛋白质含量
Lowry法检测蛋⽩质含量Lowry法检测蛋⽩质的含量1. 蛋⽩含量检测的⽅法1.1 凯⽒定氮法凯⽒定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的⼀种⽅法。
蛋⽩质是含氮的有机化合物。
蛋⽩质与硫酸和催化剂⼀同加热消化，使蛋⽩质分解，分解的氨与硫酸结合⽣成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，⽤硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋⽩质含量。
由于蛋⽩质含氮量⽐较恒定，可由其氮量计算蛋⽩质含量，故此法是经典的蛋⽩质定量⽅法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是⼀个⽤于鉴定蛋⽩质的分析⽅法。
双缩脲试剂是⼀个碱性的含铜试液，呈蓝⾊，由1%氢氧化钾、⼏滴1%硫酸铜和酒⽯酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫⾊。
紫⾊络合物颜⾊的深浅与蛋⽩质浓度成正⽐，⽽与蛋⽩质分⼦量及氨基酸成分⽆关，故可通过⽐⾊法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋⽩质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋⽩质产⽣颜⾊的深浅相近，以及⼲扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋⽩的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分⼦脲经180℃左右加热，放出⼀个分⼦氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与⼆价铜离⼦形成紫⾊络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以⼀个中间碳原⼦相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋⽩质分⼦中，酪氨酸、苯丙氨酸和⾊氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋⽩质具有吸收紫外光的性质。
吸收⾼峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋⽩质含量成正⽐。
此外，蛋⽩质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正⽐。
利⽤⼀定波长下，蛋⽩质溶液的光吸收值与蛋⽩质浓度的正⽐关系，可以进⾏蛋⽩质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使⽤。
蛋白质检测(Lowry)--方法学验证
Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
Lowry法检测蛋白质的含量
Lowry法检测蛋白质的含量一、实验原理：首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，该复合物加入酚试剂后产生蓝色复合物。
该蓝色复合物在650nm处的吸光度值与蛋白质的含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
二、配液碱性酒石酸盐溶液：称取无水碳酸钠20.0g，氢氧化钠4.0g，酒石酸钾钠0.2g，加水至1L，溶解混匀。
硫酸铜溶液：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.0g，加水至200ml，溶解混匀。
碱性铜溶液（现用现配）:量取溶液A 100ml，溶液B 2ml，混匀即得。
标准蛋白质储备液（1mg/ml)：用纯化水将牛血清白蛋白对照品定量稀释至1mg/ml，混合均匀，用1.5ml离心管分装，1ml/管，贴好标签，于-20℃或以下低温冰箱贮存。
标准蛋白质工作液（100μg/ml）:将标准蛋白质贮备液用前10倍稀释至100μg/ml。
阳性对照（约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液）：精密称取牛血清白蛋白25mg，加纯化水溶解，加入500ml容量瓶中，定容至刻度，混合均匀，冷冻管分装，每管2.5ml，贴好标签，于-20℃或以下低温冰箱贮存，有效期两年。
三、步骤：1.将标准蛋白质贮备液（1mg/ml）稀释成100μg/ml的标准工作液。
2.量取标准工作液（双份）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别加入刻度试管中，补水至1ml。
3.精密量取供试品和阳性对照1.0ml（双份）于刻度试管中；吸取1.0ml 纯化水作为空白对照。
4.加碱性铜溶液（溶液A100ml、溶液B2ml混匀）5.0ml到每一管中，涡旋混匀，室温条件放置10分钟。
5.加酚试剂（稀释至1N）0.5ml，摇匀，室温放置30分钟。
6.在650nm处用空白对照调零后，测定标准溶液的吸光度值，以及供试品和阳性对照的吸光度值。
根据标准蛋白浓度和其对应吸光度的标准曲线，计算供试品和阳性对照的蛋白含量。
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第二法，Lowry法
------摘自2010版药典
本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质的含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂
（1）酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g,置1500ml 蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10 小时。
取下回流管，加入硫酸锂150g、水50 ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。
冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂储备液。
酚试剂储备液用氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）测定酸浓度，然后加水稀释至相当于1mol/L沿酸浓度。
（2）碱性铜溶液量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5ml，4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25ml，摇匀，即得。
本液临用配制。
（3）氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）的配制及标定去氢氧化钠适量，加水搅拌使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后，量取澄清的氢氧化钠饱和溶液28ml，加新煮沸后的冷却水，使成1000ml，摇匀。
取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新煮沸过的冷水50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。
每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。
根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。
标准蛋白溶液的制备用水将蛋白标准品定量稀释至每1ml含1mg，作为储
备液。
精密量取储备液2.5ml置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为每1ml含100µg 的标准蛋白质溶液。
测定法精密量取一定体积供试品（含蛋白质50µg左右）置试管内，加水至1ml，
加碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟，快速加入酚试剂0.5ml摇匀，室温放置30分钟，显色后，照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA），在波长650nm处测定吸光度（呈色后，如果发现浑浊，经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液测定）。
精密量取标准蛋白溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，自“加水至1ml”起，同法操作。
准确量取水1ml，自“加碱性铜溶液5ml”起，同法操作，作为空白对照。
以标准品的蛋白质浓度对其相应吸光度做直线回归，求得直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。