黑灵芝中三萜及其皂苷类化合物总量的光度测定

图 1 齐墩果酸显色溶液的吸收光谱 Fig11 Absorption spectra of colored solution of oleanolic acid
3. 2 酸体系的选择 常用的体系有香草醛2高氯酸体系和香草醛2硫
酸体系 ,采用 2. 2 方法 ,仅改变酸的种类 ,以水为参 比 ,试剂空白 1 为使用高氯酸体系的空白 ,试剂空白 2 为使用硫酸体系的空白 ,每隔一定时间测定吸光 度 ,结果如下 。
加标实验 ,平均回收率为 103. 9 %。用于黑灵芝中三萜及其皂苷类成分的溶剂回流提取 、超声提取的测定 ,结果
证明这种方法是可靠的 ,可供灵芝质量控制 。
关键词 :黑灵芝 ;三萜 ;皂苷类 ;分光光度法 ;正交实验
中图分类号 :R284. 1 ;Q946. 95
文献标识码 :A
Spectrophotometric Determination of Triterpenoids and Triterpenoid Saponins in Gendarme atrum
2. 1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品 20. 0 mg , 置于 100
mL 容量瓶中 ,加甲醇使之溶解并稀释到刻度 ,密塞 , 摇匀 ,备用 。 2. 2 分析方法
精密吸取适量样品溶液或齐墩果酸对照品溶液 置于具塞比色管中 ,加热挥去溶剂 ,加入一定量新配 制的 5 %香草醛2冰醋酸液及一定量的高氯酸溶液 , 在一定温度下 ,恒温水浴一定时间后 ,流水冷至室 温 ,加入乙酸乙酯使总量为 5 mL ,摇匀 ,于一定波长 下以试剂空白为参比液测定吸光度 。 2. 3 供试样品的制备方法 2. 3. 1 超声提取法
收稿日期 :2005207208 接受日期 :2006202222 基金项目 :江西省教育厅科学技术项目 (赣教技字 200622 号) 3 通讯作者 Tel :86279128305011 ; E2mail :myxie @ncu. edu. cn
三萜类成分是灵芝的主要活性成分之一 ,测定 方法有高效液相法 ( HPLC) 、薄层色谱法 ( TLC) 等[5] 。 HPLC 法可以准确检测各种单一萜类或皂苷类的量 , 但测定皂苷的干扰较大 ,TLC 法测定皂苷 ,首先皂苷 要水解为苷元 ,操作步骤多 ,尤其是这两种方法都需 要标准品 ,而从灵芝中分离提取单一的三萜及皂苷 类化合物较困难 。Liberman2Burchard 显色方法可以 用来对萜类化合物进行定性鉴定 ,利用三萜类化合 物可以和香草醛高氯酸或硫酸试剂起显色反应[6] , 从而可以进行比色法来测定灵芝中三萜及皂苷类化 合物的总量 。
GONG Xiao2feng1 ,2 ,XIE Ming2yong1 3 ,CHEN Yi1
(1. The Key Laboratory of Food Science of MOE , Nanchang University ;2. Key Laboratory of Poyang Lake Ecology and Bio2resource Utilization of MOE , Nanchang University ,Nanchang 330047 ,China)
1. 148
10
0. 070
1. 088
0. 070
1. 088
20
0. 099
1. 102
0. 092
1. 129
30
0. 095
1. 062
0. 125
1. 087
40
0. 098
1. 058
0. 128
1. 132
50
0. 105
1. 065
0. 140
1. 109
60
0. 128
1. 043
本文先对香草醛高氯酸试剂的显色效果进行了 探讨 ,然后采用正交试验确定显色反应的最佳测定 条件 ,并对样品不同制备方法的含量进行了比较测 定 ,筛选出最佳制备方法 。结果证明这种方法是可 靠的 ,可供灵芝质量控制 。
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天然产物研究与开发 Vol118
表 1 酸体系的选择 Table 1 Selection of acid system
时间 Time (min)
试剂空白 1 Reagent blank 1
高氯酸 Perchloric
acid
试剂空白 2 Reagent blank 2
硫酸 Sulfuric
acid
0
0. 085
1. 137
0. 073
Vol118
弓晓峰等 :黑灵芝中三萜及其皂苷类化合物总量的光度测定
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表 2 因素水平表 Table 2 Levels of experimental factors
因素 显色剂用量 A
Factors Dosage of
水平
vanillin2
加热时间 B Heating time
表 3 L9 (34) 正交试验结果及其分析 Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment
序号
吸光度
No .
0. 168
1. 132
从显色结果看 ,硫酸体系显色较深 ,但放置时间 越久 ,吸光度越大 。从试剂空白值来看 ,也是硫酸体 系的高 ,考虑香草醛2冰乙酸是无色溶液 ,高氯酸也 是无色液体 ,故本实验选择高氯酸体系 。 3. 3 正交试验设计及结果
根据预试验 ,选择显色剂用量 、加热时间 、加热 温度 、高氯酸用量作为考察因素 ,设定三个水平 ,根 据因素水平表 ,选择正交表 L9 (34) 进行实验 ,本实验 以吸光度为指标 ,吸光度越大 ,说明显色越完全 。结 果见表 2 ,3 。 通 过 直 观 分 析 可 以 得 出 最 优 水 平 组 合 是 A3B1C3D3 ,香草醛用量 0. 2 mL , 高氯酸用量为 1. 2 mL ,70 ℃加热 15 min ,此条件下显色反应最完全 。
Levels
acetic acid (mL)
(min)
①
0. 4
15
加热温度 C 高氯酸用量 D
Heating
Dosage of
temperature ( ℃)
perchloric acid (mL)
50
0. 8
②
0. 6
5
60
0. 4
③
0. 2
20
70
1. 2
素试验进行了验证 。精密吸取齐墩果酸对照品溶液 0. 5 mL 若干份 ,分别置于 10 mL 具塞比色管中 ,按 2. 2 方法操作 ,改变高氯酸的加入量 ,结果如图 2 所 示。
摘 要 :采用正交试验法优化了香草醛高氯酸法测定黑灵芝三萜及其皂苷类化合物总量的显色条件 ,建立了测
定黑灵芝中三萜及其皂苷类化合物总量的分光光度法 ,检测波长为 550 nm ,回归方程为 : A = 0. 0093 C - 0. 0032
(μg) , R2 = 0. 9986 ( n = 6) ,齐墩果酸对照品在 0～128. 4μg 范围内呈良好线性关系 , RSD 为 4. 09 % ,对样品进行
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2006 ,18 :8252829
文章编号 :100126880 (2006) 0520825205
黑灵芝中三萜及其皂苷类 化合物总量的光度测定
弓晓峰1 ,2 ,谢明勇1 3 ,陈 奕1
(1. 南昌大学食品科学教育部重点实验室 ; 2. 南昌大学教育部鄱阳湖湖泊生态与生物资源利用实验室 ,南昌 330047)
称取 0. 500 g 灵芝 ,分别加入 40 mL 溶剂 (50 % ～95 %乙醇 、甲醇 、丙酮 、氯仿 、5 % Na2CO3) ,超声 30 min ,过滤 ,再加入 40 mL 溶剂超声 30 mwk.baidu.comn ,共 2 次 ,合 并滤液 ,减压浓缩 ,甲醇定容 10 mL 。 2. 3. 2 溶剂回流法
齐墩果酸 (Oleanolic acid) 对照品购自中国药品 生物检定所 ;黑灵芝由江西赣州灵芝基地提供 ,赤灵 芝及野生灵芝由江西医药公司提供 ; 高氯酸 、香兰 素 、硫酸 、乙酸乙酯 、冰乙酸 、甲醇 、无水乙醇 、丙酮 、 乙醚 、氯仿 、正丁醇 、Na2CO3 等均为分析纯 。
2 实验方法
称取灵芝 0. 500 g ,加入不同溶剂于 70 ℃回流 1 h ,过滤 ,减压浓缩 ,甲醇定容 10 mL 。
3 结果与讨论
3. 1 测定波长的选择 将齐墩果酸对照品加显色剂显色后 ,在紫外可
见分光光度计上扫描 ,得吸收光谱图 ,结果见图 1 。 从图中可见 ,齐墩果酸显色溶液在 548 nm 处有一最 大吸收峰 ,故确定 550 nm 为测定波长 。
灵芝为担子菌纲 ,多孔菌科 ( Polyporaceae) 灵芝 属 ( Ganoderma) 真 菌 灵 芝 ( G. lucidum ) 和 紫 芝 ( G. japonicum) 的总称 。灵芝属真菌 ,国内有二十多种 , 包括赤芝 、黄芝 、紫芝 、黑芝 、薄盖灵芝 、树舌等 。国 内外研究过的灵芝属真菌仅有赤芝 ( G. lucidum) 、紫 芝 ( G. japonicum) 、树舌 ( G. applanatum) 、薄 盖 灵 芝 ( G. capense) 、南方灵芝 ( G. austrole) 等五种 ,其中研 究最多的是赤芝 ,紫芝次之 ,从中分离得到的多糖 类 、三萜类 、核苷类 、甾醇类 、生物碱类等有效成份成 为研究热点 。而有关黑灵芝中有效成分的研究却鲜 有报道 ,尤其是灵芝三萜及皂苷类化合物总量的测 定未见任何报道 ,作者已对江西赣州黑灵芝微量元 素形态分布 、抗氧化作用等进行了一些研究[124] 。
1 材料与试剂
1. 1 主要仪器与设备 UV2800 紫外可见分光光度计 (上海 UNICO) 、TU2
1901 型 双光束紫外可见分光光度计 (北京普析) 、 BS224S 电子天平(德国赛多利斯) 、HH24 型数显恒温水 浴锅(国华电器有限公司) 、HY23 型多功能调速振荡器 (金坛环宇) 、DGG29104 B 型电热恒温鼓风干燥箱 (上海 森信) 、RE252A 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) , ZK∃82A 型真空干燥箱(上海实验仪器总厂) ,LJX ∃ Ⅱ型 离心沉淀机 (上海医用分析仪器厂) 1. 2 药材与试剂
Abstract :The spectrophotometric determination of triterpenoids and triterpenoid saponins in Ganoderma atrum was established and the condition was optimized by orthogonal design. The detection wavelength was chosen at 550 nm. The operating curve (A = 0. 0093 C - 0. 0032μg) was found to be linear over the range from 0 to 128. 4μg for oleanolic acid in methanol ( R2 = 019986) . The recovery is 103. 9 % and RSD is 4. 09 %. The method has been successfully applied to determine and compare the extract rates of triterpenoids and triterpenoid saponins in Ganoderma atrum by different solvents. The results show this method is reliable and can be used as the quality control of Ganoderma atrum . Key words : Ganoderma atrum ;triterpenoid ;triterpenoid saponin ;spectrophotometry ;orthogonal design