石蜡切片免疫组化染色步骤

2.3 皂素（Saponin） ：一般使用浓度为 2~10g/ml 的 saponin 溶液，消化时间为室温孵育 30 分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或 水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如 TBS、PBS、 重金属盐溶液等，但实验证明，以 0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0） 效果最好。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂） 配制，取该粉剂一包溶于 1000ml 的蒸馏水中，混匀，其 pH 值在 6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的 pH 值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2 处理 10 分钟，蒸馏水洗 2 分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液 （工作液） 的容器中， 置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92℃ ~98℃之间并持续 10~15 分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉， 请根据具体机型酌情设置条件， 务必满足以上步骤中对温度和时间的 要求） 。取出容器，室温冷却 10~20 分钟（注意：不可将切片从缓冲 液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型） 。PBS 洗，下 接免疫组化染色步骤。 3.2 石 蜡 切 片 高 压 抗 原 修 复 操 作 方 法 ： 切 片 脱 蜡 至 水 。 将 1500ml~3000ml 的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加 热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖 锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热 5~6 分钟后） ，计时 1~2 分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅
6．PBS 洗涤 3×3 分钟。 7．滴加二抗，室温 30 分钟。 8．PBS 洗涤 3×3 分钟。 9．加 PAP 复合物，室温 60 分钟。 10． 11． 12． 13． PBS 洗涤 3×3 分钟。 0.04％DAB＋0.03％ H2O2 显色 5～10 分钟。 充分水洗。 苏木精复染，封片观察。
3） PAP 法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法） 1．标定固定后，PBS 洗涤。 2．1％H2O2（或 1％H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温 10～20 分钟。 3．PBS 洗涤 2×3 分钟。 4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温 20 分钟。 5．滴加一抗，室温 1 小时或 4℃过夜。
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游 离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分 离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定 蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来， 至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类， 可先在过 柱前透析一夜， 否则， NH4+太浓， 在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+， 因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集， 之后出现 SO4++ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。 最后是 NH4+， （用 纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4++及 NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体， 可用 1×20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。 （四）DEAE 纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除 去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。 装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。 常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据 床体积大小每梯度乘 3） ，然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐 水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。 （3）将肝匀浆装入离心管内（1/3 左右） ，交换地用 2～3 倍量生 理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用 2000r/min 离心沉淀 15min 后，再除去上清液。 （4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀， 将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜） 。 （5）在乳钵中充分研磨，用 120 目铜筛筛选过后，分装，密封， 低温干燥保存。 （二）透析法 荧光素如 FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过， 可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。 （1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液 面稍留空隙，紧扎。 （2）浸入 0.02mol/ph 7.1～7.4 的 PBS 中（悬于大于标记物体积 约 50～100 倍的 PBS 内） ，在 4℃中透析，每日更换 3～4 次 PBS，约 5～7 天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下） 。 （三）葡聚糖凝胶 G-50 柱层析法 除游离荧光素可用 2×46cm 柱层析法，详细方法参阅第二章 。 加入荧光抗体 15～18ml（按床体积的 5%～10%加样） ，使其缓慢渗入 柱内， 待即将全部入柱时， 加入 PBS 少许， 关闭下口， 停留 30～40min ， 使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。
4） 双 PAP 法 1～10 同单 PAP 法。 11． 12． 13． 14． 15． 16． 二次加酶标二抗。 PBS 洗。 二次加 PAP。 PBS 洗。 0.04％DAB＋0.03 ％H2O2 显色 5～10 分钟。 苏木精复染核，封片，镜检。
5） ABC 法（卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法） 1～8 同 PAP 法 9）加 ABC 液，室温 60 分钟。 10） PBS 洗。
二、消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当 的方法，常用的方法有以下几种： （一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠） ，其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡 胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉 50～100mg,在离心管中充分混 匀，在室温中振动 2h，4℃中过夜，再搅拌 10min，高速离心 （3000～ 15000r/min）30min，1～2 次后，即可使用其上清液。吸收一般应在 临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过 2 周。染色应作吸 收前后之比较， 吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿， 离心 （3000～ 15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免 消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法， 对荧光抗体的 荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用 相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据 Hiramotos 氏等 的方法将组织的 20% 生理盐水匀浆液，用生理盐水洗 2 ～ 3 次， 12000r/min 10min 离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达 到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常 用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。 【肝粉的制法】 （1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐 水洗 2～3 次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
育 10~30 分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温 孵育 10~30 分钟。 4.9 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.10 显色剂显色（DAB 或 AEC） 。 4.11 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 4~8mm， 室温放置 30 分钟后， 入 4℃丙酮固定 10 分钟， PBS 洗，5 分钟×3。用 3％过氧化氢孵育 5~10 分钟，消除内源性过氧化 物酶的活性。PBS 洗，5 分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。 细胞免疫化学：免疫酶标技术 1） 直接法 1．标本固定。 2．PBS 洗涤 2×3 分钟。 3．1％ H2O2（或 1％ H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温 10～ 20 分钟。 4．正常血清（1：10）孵育，室温 20 分钟。 5．滴加酶标记的抗体 37℃1 小时或 4℃过夜。 6．PBS 洗涤 3×3 分钟。 7．DAB＋H2O2 显色 5～10 分钟，镜下控制染色结果。DAB＋H2O2 应用前 15 分钟配制。
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极 易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂，对 已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES： 现用现配。 将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中，停留 20~30 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮 去未结合的 APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意 组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中， 停留 1~2 分钟， 然后用双蒸水快速清洗三次， 室温干燥或 60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀 释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡 5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温 过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶： 一般使用浓度为 0.05%~0.1%， 消化时间为 37℃、 10~40 分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为 0.4%，消化时间为 37℃、30~180 分 钟， 主要用于细胞间质抗原的显示， 如： Laminin （层粘蛋白） ， Collagen IV（IV 型胶原）等。
盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS 洗 2 分钟×3，下接免疫组化染色 步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛 有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数 量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达 92℃ ~98℃起开始计时 15~20 分钟，然后端离电炉，室温冷却 20~30 分钟， 蒸馏水冲洗，PBS 洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国 ZYMED 公司 SP 试剂盒为例） 4.1 石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2 室温孵育 5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后 进行)。 4.4 5~10％正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育 1~2 小时或 4℃过夜。 4.5 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释） ，37℃孵 育 10~30 分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵 育 10~30 分钟。 4.7 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.8 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释） ，37℃孵
11） 12） 13）
0.04％DAB＋0.03％ H2O2 显色 5～10 分钟。 充分水洗。 苏木精复染核，封片，镜检。
免疫荧光非特异性染色的消除方法
一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂， 其产生的原因主要可分为以 下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物， 而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可 与组织成分结合。 （ 3 ）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如 Forssman 氏抗原） ，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往 往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体 分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。
8．充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。
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2） 间接法 1．标本固定。 2．PBS 洗涤 2×3 分钟。 3．1％H2O2（或 1％H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温 10～20 分钟。 4．正常血清（1：10）孵育，室温 20 分钟。 5．滴加第一抗体，37℃1 小时或 4℃过夜。 6．PBS 洗涤 3×3 分钟。 7．滴加酶标二抗，室温 1 小时。 8．PBS 洗涤 3×3 分钟。 9．0.04％DAB＋0.03 ％H2O2 显色 5～10 分钟。 10． 充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。