PCR实验室标本管理、生物安全和防污染策略

2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR 检测，痰标本的处理只能室温悬浮于生理 盐水中，充分震荡混匀，促使大块粘状物 下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可 用于核酸提取。
五、棉拭子
使用PCR方法检测性疾病病原体时，临床 标本一般为棉拭子，可将棉拭子置于适量 生理盐水中，充分震荡洗涤后，取上清立 即离心，其后的沉淀即可用于DNA提取。
保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作 法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小 于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边 摇边加入无水乙醇至浓度为50%，这样固定的组 织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。
石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱 蜡，再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。
在-70℃下。
二、全血标本 以全血作为
待测标本时
1. 抗凝剂的选择 以全血作为待测标本 时，一般使用EDTA-Na2或枸橼酸钠， 不可使用肝素。
2. 保存全血样本用于DNA提取检测，可 4℃下短期保存，如用于RNA检测， 则 应在取血后尽快提取RNA。
三、外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液，裂解 全血中的红细胞，经生理盐水数次洗涤， 即可看到单个核细胞。
标本的类型和采集量
标本的类型：血清（浆）、分泌物、痰、 尿和脑脊液等。
标本的采集量：应根据所测病原体而定。 一般来说，如果标本的量对病原体培养够 用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其 后的扩增检测
对于定量检测来说，对标本的收集要求更 为精确。
采集质量的评价
血清（浆）标本：溶血、脂血等；
分泌物、痰：评价评价内容包括细胞组成， 所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法：包括肉眼观察，显微镜下观察 和化学分析等。
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检 测实验室。
样本中如加入适当的稳定剂，如用于 RNA测定加入GITC的血清（浆）样本和 用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在 室温下运送过邮寄。
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各 种临床样本的运送条件作出相应的规定。
第一节 临床标本的处理和保存
保存 如不立即用于核酸提取，则需保存 于-70℃下。
六、脓液
脓液的处理依情况而定。
如用于分枝杆菌（如结核杆菌）核酸测定 的标本，粘稠的脓液可采用痰标本的处理 模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心，沉淀用于 生理盐水洗2-3次后，即可用于DNA提取。
对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如 过于粘稠，则加入适量生理盐水，充分振 荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于 DNA提取；如为水样，则按上述直接离心 取沉淀即可。
采样及运输容器
标本的采集材料如棉签应为一次性使用； 运输容器亦应为密闭的一次性装置； 采集所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料
不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。
标本采集中的防污染
采集中要特别注意污染，防止混入操作 者的头发、表皮细胞、痰液等；
如使用玻璃器皿，必须经高温灭菌，以 使用可能存在的RNase失活。
保存 外周血单个核细胞如暂不提取核酸， 可保存于-70℃下。
四、痰
特点 痰属于分泌物，痰标本中含有大量粘 蛋白和杂质。
处理 1、如作结核杆菌DNA测定标本，提 取核酸前，需对标本进行初步处理，即用 1mmol/LNaOH液化。需注意的是，液化时 不能加热，液化时间不能过长。
保存 液化标本如不立即用于核酸提取，可 保存于-70℃下。
保存 沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
七、体液
临床体液标本包括胸水，腹水，脑脊液， 尿液等，可按水样标本的方式直接离心取 沉淀提取核酸。沉淀样本的保存同上。
八、组织
组织分新鲜组织块和石蜡切片。 新鲜组织块的处理步骤 首先用生理盐水洗两次，
然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡 混匀，离心，弃上清，再加蛋白酶K消化后提取 核酸。 保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作 法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小 于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边 摇边加入无水乙醇至浓度为50%，这样固定的组 织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。
PCR实验室标本管理、生物 安全和防污染策略
标本采集时间对扩增检测结果 的影响
在疾病发展过程中，标本采集过早 或过晚都可能会给出假阴性结果。
标本采集部位的准备
标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生 物或其他杂物，但应适度，过度清洁消毒有 可 能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位 的 准备应由训练有素的人员进行。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。 如果一次试验中的几个阴性对照结果中出现一个或 几个阳性结果，提示本次试验中其他标本的检验结 果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染 扩增试剂污染扩增产物交叉污染等
常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中 形成的喷雾、DNA抽提、仪器、试剂及Leabharlann Baidu他与扩增产 物接触的物品。
一、血清（浆）标本 1. DNA标本 DNA标本的获取、处理和保存， 可按照一本的血清标本处理程序即可。 2. 保存全血样本用于DNA提取检测，可4℃下短期保 如用于RNA检测， 则应在取血后尽快提取RNA。
容器的使用
2.RNA标本处理和保存 对于RNA测定，标本 的 获取、处理和方式对测定结果有决定 性影响。研究表明，用于RNA测定的血浆 标本最好是使用EDTA抗凝（严禁使用肝素， 因其对PCR扩增有几只，且很难在核酸提 取过程中完全去除），抗凝后6小时内分 离血浆保存 ；如使用血清标本，则需尽 快（2小时）分离血清后保存。保存时间 短时（1-2周）可放-20℃下，较长期时应
小结
1、标本的收集及适当的预处理，对用于 PCR测定的核酸模板的成功提取，具有决 定性作用。
2、要着重强调的一点是，所有用于上述临 床标本收集的容器如试管或离心管，均应 使用前高压灭菌。
PCR污染与对策
PCR反映的最大特点是具有较大扩增能力与较高的灵 敏性，但令人头痛的问题是易污染，机器微量的污 染即可造成假阳性的产生。