第三章 病毒1

噬菌体效价的测定
将少量噬菌体与大量敏感 菌混合培养在营养琼脂中，在 平板表面布满宿主细胞的菌苔 上,可以用肉眼看到一个个透 明的不长菌的小圆斑，称为噬 菌斑。(每个噬菌斑一般是由 一个噬菌体粒子形成的。) 噬菌斑可用于检出、分离、 纯化噬菌体和进行噬菌体的计 数。 一个直径2mm的噬菌斑中噬 菌体含量达107 ～ 109个。
• 液体稀释管法 与用于细菌活菌计数中的系列稀 释法相似。不同处是：①各试管中均加有培养液； ②各管中均须接入处于对数期的宿主细胞；③以 不长菌的最高稀释管来计算效价。
噬菌体效价的测定
• 斑点试验法 这是一种半定量的预试验方法。先 将敏感的宿主菌浓悬液涂布于合适的培养基平板 上，然后使平板表面朝下，在45℃左右的温箱中 使平板表面不留水膜。再把不同稀释度待测试样 依次用接种环点种在上述平板上。保温数小时后， 根据点样处是否产生噬菌斑即可初步判断该试样 的效价。
一一得到填补。总的说来，动物病毒以线状的
dsDNA和ssRNA为多，植物病毒以ssRNA为主，噬菌
体以线状的dsDNA居多，而至今发现的真菌病毒都
是dsRNA，藻类病毒则都是dsDNA。
病毒的种类

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原核生物病毒——噬菌体 植物病毒


人类和脊椎动物病毒
昆虫病毒

噬菌体概述
噬菌体是原核生物的病毒，包括噬细菌
烈性噬菌体的裂解性周期
各 种 核 酸 型 病 毒 的 复 制 特 点
烈性噬菌体的裂解性周期
第Ⅰ型——病毒双链DNA的复制：病毒DNA的复制、转录和转译 均按“中心法则”进行。DNA既可作复制的模板，通过半保留方式 复制出子代病毒的DNA，又可转译成成熟病毒所需的衣壳蛋白。 第Ⅱ型——病毒单链DNA的复制：所有ssDNA病毒的核酸均为＋ DNA。先由＋DNA合成±DNA，然后以新合成的－DNA为模板合 成＋mRNA。 第Ⅲ型——双链RNA病毒的复制：首先通过半保留方式复制利用 其中的“－”链产生“＋”RNA，即mRNA，它可转译出蛋白质， 又可作为模板以复制出子代双链RNA。 第Ⅳ型——侵染性单链RNA病毒的复制：侵染性ssRNA指由病毒 粒子中分离出来的RNA便有侵染性。这种侵染性RNA既可作为 mRNA以转译成蛋白质，又可作为模板复制成-RNA，然后再利用 此－RNA作模板来合成子代＋RNA。
烈性噬菌体的裂解性周期
⑤裂解（释放）： 成熟后以脂肪酶和溶菌酶 作用裂解细胞。这种方式 与自外裂解方式现象相似。 裂解时间：E.coliT系列 噬菌体在合适的温度等条 件下，仅需15～25min. 裂解量：平均每一宿主细 胞裂解后产生的子代噬菌 体数量。T2：150；T4： 100。
烈性噬菌体的裂解性周期
一步生长曲线
定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线，称作一步 生长曲线或一级生长曲线（one-stepgrowthcurve）。 因它可反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数—— 潜伏期（latentphase）、裂解期（risephase）和裂 解量（burstsize），故十分重要。
噬菌体效价的测定
• 单层平板法在上述双层平板法中省略底层，但所 用培养基的浓度和所加的量均比双层平板法的上 层为高和多。此法虽较简便，但其实验效果较差。
噬菌体效价的测定
• 单层平板法与双层平板法相比较 双层平板法主要有 以下几个优点：①加了底层培养基后，可使原来底面 不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；②所形成全部噬菌 体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的 大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重 叠现象（图4-8）；③因上层培养基中琼脂较稀，故 形成的噬菌斑较大，更有利于计数。
噬菌体效价的测定
• 双层平板法 是一种被普遍采用并能精确测定效 价的方法。预先分别配制含2％和1％琼脂的底层 培养基和上层培养基。先用前者在培养皿上浇一 层平板，再在后者（须先融化并冷却到45℃以下） 中加入较浓的对数期敏感菌和一定体积的待测噬 菌体样品，于试管中充分混匀后，立即倒在底层 平板上铺平待凝，然后保温。一般经十余小时后 即可进行噬菌斑计数。现把双层平板法简括如下：

烈性噬菌体的裂解性周期

第Ⅴ型——非侵染性单链RNA病毒的复制：这类病毒的单链RNA没有侵染性，
也不能起信使作用，所以叫负链RNA（－RNA）。当病毒粒子携带转录酶时，
－RNA可用作转录＋RNA（即mRNA）的模板，并由它转译出几种蛋白质，其
中包括一种RNA复制酶。在这种RNA复制酶的催化下合成与负链等长的＋RNA，
基本特点
形体极小（以nm计），能通过滤菌器，电镜观 察； 无细胞构造，主要由蛋白质、核酸构成，因此 被称为“分子生物”； 每种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA； 生活方式为专性活细胞内寄生，病毒酶系不全， 离开活体后无生命特征； 病毒以复制的方式增殖,包括核酸复制、核酸蛋 白质装配，是在分子水平上进行的； 对抗生素不敏感，对干扰素敏感； 有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中。
•复合对称
的结构(蝌 蚪状)
群体形态
SARS在人肺部形成的包涵体
高 粱 煤 纹 病
三类典型形态的病毒及其代表

螺旋对称的代表——烟草花叶病毒 二十面体对称的代表——腺病毒 复合对称的代表——T偶数噬菌体


螺旋对称的代表——烟草花叶病毒（TMV）
TMV 衣壳粒（95%） ssRNA（5%）
2130个亚基
体、噬放线菌、噬蓝细菌体等。
噬菌体在自然界广泛存在，1995年ICTV病
毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种， 分别划归为49个病毒科。
噬菌体的分类
据Bradley(1967)归纳，噬菌体共有六类形态。
噬菌体的分类
噬菌体(phage)的繁殖 噬菌体的繁殖病毒粒子并无个体的生 长过程，而只有其两种基本成分的合成和 装配，即： 噬菌体的繁殖一般可分五个阶段，即: 吸附→侵入→增殖（复制与生物合成）→ 成熟（装配）→裂解（释放）。
烈性噬菌体的裂解性周期
②侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌体尾部所含 酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩， 尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳 留在细胞外。
烈性噬菌体的裂解性周期
③增殖：包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿 主细胞后，会控制宿主细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中 的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。
烈性噬菌体的裂解性周期
烈性噬菌体的裂解性周期
烈性噬菌体的裂解性周期
①吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异
性结合，噬菌体以尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突“钉”
在细胞表面上。
烈性噬菌体的裂解性周期
一个细菌表面约有300个吸附位点。不同 的噬菌体有不同的吸附位点: 噬菌体 •E．coli T3、T4、T7 吸附位点 脂多糖
噬菌斑
噬菌体效价的测定
效价（titre，titer）这一名词在不同的场合 有其不同的含义。在这里，效价表示每毫升试样 中所含有的侵染性的噬菌体粒子数，也即噬菌斑 形成单位（pfu，plaque-formingunit）数或感
染中心（infectivecentre）数。
噬菌体效价的测定
噬菌体效价的测定
噬菌体(phage)的种类

烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够在短时间内 完成吸附、侵入、增殖、成熟和裂解五个阶段，最 终导致宿主细胞裂解的噬菌体。

温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞 后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且 可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，一般情况下，
不引起寄主细胞裂解的噬菌体。
再以此作模板合成子代病毒的－RNA。

第Ⅵ型——逆转录病毒单链RNA的复制：逆转录病毒单链RNA在其复制过程中
会形成RNA-DNA杂交分子和双链DNA这两种中间体。RNA-DNA杂交分子是在
病毒粒子中所含的一种反转录酶——依赖于RNA的DNA聚合酶的催化下而合成
此双链DNA（±DNA）具有侵染性，并可整合到宿主细胞的DNA分子上，以它
第四章
病毒和亚病毒
概述
病毒（Virus）是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分 组成的 超微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或 RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。
非细胞生物
真病毒：至少含有核酸和蛋白质两种组分 类病毒：只含具有独立侵染性的RNA组分 亚病毒 拟病毒：只含不具独立侵染性的RNA组分 朊病毒：只含单一蛋白质组分
大小
大小
直径多在100nm左右，一般处于20-200nm，最大的病 毒是米米病毒，达800nm。
脊髓灰质炎病毒 （28nm）
天花病毒 （230-300nm）
米米病毒 （800nm）
形态
构造
构造
衣
壳
核衣壳
核 酸 包膜 刺 突
病毒的基本构造
对称体制
廿面体对
称的结构
(球状) •螺旋对称 的结构(杆 状)
噬菌体效价的测定
• 玻片快速法将噬菌体和敏感的宿主细胞与适量的 琼脂培养基（含0.5～0.8％琼脂，事前融化）充 分混合，涂布在无菌载玻片上，经短期培养后， 即可在低倍显微镜或扩大镜下计数。例如，用于
Staphylococcusaureus（金黄色葡萄球菌）噬菌
体的效价测定，仅需2.5～4.0小时即可，唯精确 度较差
6390个核苷酸
相对分子量： 2X10E+6
158AA/base 相对分子量：17500
二十面体对称的代表——腺病毒
腺病毒 dsDNA （36500bp） 12角（12个） （五邻体）
衣壳粒 20面（240个） （六邻体）
刺突
腺病毒结构模型
30棱
复合对称的代表——T偶数噬菌体
以大肠杆菌T4噬菌体为例 头部：廿面体对称结构，由蛋白 质衣壳构成，内含一条DNA。 颈部：薄盘状，附颈须。 尾鞘：长95nm, 衣壳粒螺旋对称； 可伸缩。 尾髓:中空，DNA可由此进入细胞。 基板: 六角形盘状物，其上有刺 突、尾丝。 刺突: 有吸附功能。 尾丝: 有识别吸附功能。
•E．coli T2和T6
•枯草杆菌SP-50噬菌体 •沙门氏菌的x噬菌体 •E．Coli f2、MS2
脂蛋白
磷壁酸 鞭 毛 F 菌毛
烈性噬菌体的裂解性周期
吸附作用受许多内外因素的影响： •噬菌体的数量：由于每一宿主细胞表面的特异受体有限，因此所 能吸附噬菌体的数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的相应 噬菌体的数量，就称感染复数（m．o．i，multiplicity of infection）。感 染复数一般很大，可达250～360。如大量噬菌体粒子同时吸附于一 个敏感细胞，由于每个噬菌体粒子的尾管口都带有少量的溶菌酶， 就会使宿主细胞表面顿时出现“千疮百孔”，从而发生了裂解。这 种由于超m．o．i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌 体的裂解，称为自外裂解（lysisfromwithout）。 •阳离子：Ca2+、Mg2+和Ba2+等阳离子对吸附有促进作用；Al3+、Fe3+ 和Cr3+等阳离子则可引起失活。 •辅助因子：色氨酸可促进T4的尾丝摆脱颈须的束缚，有促吸附作 用；生物素可促进产谷氨酸细菌噬菌体的吸附作用。 •pH值：在中性时有利于吸附，在＜5和＞10时不易吸附。 •温度：往往在生长最适温度范围内最有利于吸附。 利用某些理化因子对吸附的促进作用和抑制作用，在发酵工业 中对防止噬菌体的污染有一定的意义。
的。所合成的DNA链在一种依赖于DNA的DNA聚合酶的作用下再合成双链DNA。
为模板合成子代单链RNA。其子代RNA和亲本RNA均可作为mRNA合成各种蛋
白质，包括刺突的糖蛋白、内部蛋白、逆转录酶和转化蛋白等。这种转化蛋白在 适当的时候可把宿主细胞转化成肿瘤细胞。
烈性噬菌体的裂解性周期
④成熟（装配）： 主要步骤有： DNA分子的缩合——通过衣壳包裹DNA而形成头部—— 尾丝及尾部的其它部件独立装配完成——头部与尾部 相结合——最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、 大小相同的噬菌体装配完成。
大肠杆菌T4噬菌体构造
复合对称的代表——T偶数噬菌体
病毒核酸的分类指标

DNA还是RNA
单链还是双链


线状还是环状
闭环还是缺口环 基因组是单分子、双分子、三分子还是多分子 核酸的碱基或碱基对数等



病 毒 的 核 酸
（接上表）
病 毒 的 核 酸
病毒的核酸
由上表可知，病毒的核酸类型是极其多样的， 历史证明，往往暂时还属空缺的核酸类型，不久将