巴斯德毕赤酵母表达系统PPT课件
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巴斯德毕赤酵母表达系统研究系统进展
➢翻译后修饰
毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差 异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到 一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而 失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。
解决糖基化策略：
①尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；
②对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基 化；
稀有密码子制约翻译速率
此时需要进行全基因的合成，使编码序列 符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的
➢基因剂量
相对剂量效应
一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。
重组子在酵母细胞中的命运
导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到 染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：
（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和 3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤 酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶 只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲 醇利用缓慢，表型为Muts。
若整合发生在his4位点处，可能出现表达单 元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表 达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。
his4
用于转化子筛选的基因标记
用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养 缺陷型互补基因和显性基因：
二、巴斯德毕赤酵母简介
Pichia pastoris
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能 够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效 诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达， 因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属 强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵 母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵 母没有合适的自主复制型载体，所以外源基 因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA 上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功 表达。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述27页PPT
诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。
高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。甲 醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用。
（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe) 表达系统
只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母， 因此定名为裂殖酵母。与前面几种酵母相比， 它具有更多的与高等真核生物相似的特性： 线 粒体结构、 启动子结构、 转录机制和对蛋白2端 酰基化功能均更接近于哺乳类细胞， 因而正逐 渐成为研究真核细胞分子生物学的模式生物， 它作为外源基因表达系统也开始受到人们的关注。 目前， 已经有多种蛋白利用此系统进行了表达， 如人蛋白凝血因子)G、 细胞色素 V6:8、 人白细 胞介素 YL’D等。此系统表达的外源蛋白更接近 于它们的天然形式 。
的真核生物， 其全序列的测定已于 2019年完成 。 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分
子量大于30 kD 的外源蛋白质，也不能使所表达的外源 蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C 端往往被截短。 因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。 酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型 和整合型两种。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋 白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40 个以上的 甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链仅含有末端1, 3 甘 露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用 来制备亚单位疫苗(如默克乙肝疫苗、口蹄疫疫苗等)。
1993年，Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给 Research Corporation Technologies公司，并委托Invitrogea公司 进行有关产品销售。
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。
高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。甲 醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用。
（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe) 表达系统
只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母， 因此定名为裂殖酵母。与前面几种酵母相比， 它具有更多的与高等真核生物相似的特性： 线 粒体结构、 启动子结构、 转录机制和对蛋白2端 酰基化功能均更接近于哺乳类细胞， 因而正逐 渐成为研究真核细胞分子生物学的模式生物， 它作为外源基因表达系统也开始受到人们的关注。 目前， 已经有多种蛋白利用此系统进行了表达， 如人蛋白凝血因子)G、 细胞色素 V6:8、 人白细 胞介素 YL’D等。此系统表达的外源蛋白更接近 于它们的天然形式 。
的真核生物， 其全序列的测定已于 2019年完成 。 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分
子量大于30 kD 的外源蛋白质，也不能使所表达的外源 蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C 端往往被截短。 因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。 酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型 和整合型两种。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋 白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40 个以上的 甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链仅含有末端1, 3 甘 露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用 来制备亚单位疫苗(如默克乙肝疫苗、口蹄疫疫苗等)。
1993年，Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给 Research Corporation Technologies公司，并委托Invitrogea公司 进行有关产品销售。
酵母表达系统-PPT课件
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力
C、抗性标记；neo 提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
KM71:His+Muts
3’His4
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1
3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
巴斯德毕赤酵母
1）基因插入 AOX1 或 aox1::AGR4 位点
2）基因插入 His4 位点
3）多拷贝插入表达载体 如 pPIC9K，pPIC3.5K
3.实验方法及结果
1) 酵母表达载体 pPICZαB-ggh 的构建
带有 KpnⅠ和 NotⅠ两种酶切 位点的 GGH 引物
pPIC9K-ggh
ggh 基因 连 pMD19-T Simple Vector
1基因插入aox12基因插入his4酵母表达载体ppiczbggh的构建ppic9kggh带有kpn和ggh引物ggh基因pmd19tsimplevectorcolijm109验证抽提质粒kpnppiczbppiczbgghcolijm109转化筛选阳性克隆pcr双酶切鉴定2000bp左右的dna片段2重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞510ppiczbgghpme线性化56kb片段回收20保存备用电转化biorad涂布培养30免疫斑点法筛选高表达菌株将菌落转移到醋酸纤维素薄膜上bmmy平板上置同样大小的022的硝酸纤维素薄膜将醋酸纤维素薄膜菌落面向上置于硝酸纤维素薄膜上30培养80h上层醋酸纤维素薄膜转移至md平板上保存下层硝酸纤维素薄膜取出5脱脂奶封闭次
本研究证明了两次电转携带有同种目的基因的不同分泌型表 达质粒，通过高浓度的抗生素结合免疫法筛选， 不仅可以提高目的基因的拷贝数，并且在一定范 围内提高了外源蛋白的表达量。这种双质粒共 表达体系不仅可以提高单一蛋白在宿主中的表 达量，还可以实现两种不同的蛋白在同一宿主 中的共表达。
4.讨论
3）本实验通过建立双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母中的表达，然后通过高浓度的抗生素抗性结合 免疫斑点法进行高通量的筛选，获得的高产菌 GS115/F 3 融合蛋白的表达量将近提高了一半，和出发菌株 GS115/F 2 相比表达的蛋白质结构一致。影响外源蛋白在毕赤酵母 中的表达因素还很多，它不仅受外源基因特性的影响，也 受到宿主菌、Mut表型、酶切和糖基化及培养条件 的影响，所以应从影响毕赤酵母蛋白表达的多种 因素着手提高融合蛋白 GGH 的表达量，实现 规模化制备。
《酵母基因工程》PPT课件
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认 定为安全的基因工程受体系统。
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
测序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸 收 线 型 DNA 的 能 力 明 显 大 于 环 状 DNA， 二者相差80倍。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳 定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制 备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢ 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基 因的表达
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
测序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸 收 线 型 DNA 的 能 力 明 显 大 于 环 状 DNA， 二者相差80倍。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳 定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制 备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢ 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基 因的表达
毕赤酵母表达系统
毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。
基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
第五页，编辑于星期三：四点 七分。
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
第六页，编辑于星期三：四点 七分。
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
第二十三页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。 同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。 这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它 转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传。
第二十四页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝 粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序 列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行 为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并 均匀地分配到子代细胞中，同时在宿主细胞 中的拷贝数很低。
特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重 组。
• 酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核
DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其既可 以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。
第二十二页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不多， 而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型的，因 此目前用于外源基因克隆和表达的载体质粒 都是由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自 主复制子结构(ARS)、中心粒序列(CEN)、 端粒序列(TEL)以及用于转化子筛选鉴定的 功能基因构建而成。
第二十一页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在 于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特点 是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分为 两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
第六页，编辑于星期三：四点 七分。
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
第二十三页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。 同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。 这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它 转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传。
第二十四页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝 粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序 列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行 为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并 均匀地分配到子代细胞中，同时在宿主细胞 中的拷贝数很低。
特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重 组。
• 酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核
DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其既可 以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。
第二十二页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不多， 而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型的，因 此目前用于外源基因克隆和表达的载体质粒 都是由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自 主复制子结构(ARS)、中心粒序列(CEN)、 端粒序列(TEL)以及用于转化子筛选鉴定的 功能基因构建而成。
第二十一页，编辑于星期三：四点 七分。
• 酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在 于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特点 是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分为 两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控
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一般分为三个阶段：
①成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌 量，该阶段一般采取分批补料的方式进行；
②过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳 源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏；
③诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中 流加甲醇诱导重组蛋白的表达。
17
应用举例
3
• 80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。
• 1993年Philips pertoleum公司委托Invrtigone公 司代理毕赤酵母表达系统的产品。
8
醇氧化酶（AOX）
甲醇 AOX
甲醛 H2O2
微体 细胞
9
毕赤酵母质粒载体
10
几个概念
• 同源基因重组 ：同源染 色体的非姐妹染色单体的 交叉互换引起的互换重组
• 穿梭质粒：是指人工构建的 具有两种不同复制起点和选 择标记，可在两种不同类群 宿主中存活和复制的质粒载体。
11
pPIC9k质粒图谱
依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具 有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白
Exenatide
Twice a day
2.4h被代谢
Exenatide
HSA
PCR 基因重组
Exenatide
HSA
Once a week
18
毕赤酵母表达外源蛋白示例
19
谢谢大家！！
20
个人观点供参考，欢迎讨论！
14
Mut表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型
Mut+ 存在
存在
正表型
Muts 缺失
存在
缓慢型
Mut- 缺失
缺失
负型
15
选择过程
HIS4缺陷培养基
导入质粒
G418酵母培养基
低
高
G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性
16
发酵过程
巴斯德毕赤酵母表达系统
报告人：彭平平
1
2
起源及背景
• 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年 代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
• 30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用 甲醇为唯一的碳源和能源.
• 70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连 续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。
• AOX--醇氧化酶 • S --- 分泌信号
• MCS –多克隆位点 • TT---终止信号
• HIS4--组氨醇脱氢酶 • Kanamycin---抗卡拉霉素基因 • pBR322---大肠杆菌的复制起始位点 • Ampicillin---抗氨苄青霉素基因
12
外源蛋白的引入表达
13
菌株类型
6
结构特点
一、单细胞微生物 1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、
折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
7
二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降 解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H202对细胞的毒害。
5
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3 连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用 于临床应用
6、使用方便、简单，而且成本较低
4
毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点
1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度 生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从 而进行高效表达
2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构 稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合 到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株
3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基 因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达
①成长期，该阶段以甘油为碳源，主要目的是收获一定的菌 量，该阶段一般采取分批补料的方式进行；
②过渡期，随成长期的结束酵母即进入过渡期，该期不加碳 源，目的是消耗掉甘油，解除对AOX1启动子阻遏；
③诱导期，即当甘油被消耗尽，过渡期结束时，在发酵液中 流加甲醇诱导重组蛋白的表达。
17
应用举例
3
• 80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。
• 1993年Philips pertoleum公司委托Invrtigone公 司代理毕赤酵母表达系统的产品。
8
醇氧化酶（AOX）
甲醇 AOX
甲醛 H2O2
微体 细胞
9
毕赤酵母质粒载体
10
几个概念
• 同源基因重组 ：同源染 色体的非姐妹染色单体的 交叉互换引起的互换重组
• 穿梭质粒：是指人工构建的 具有两种不同复制起点和选 择标记，可在两种不同类群 宿主中存活和复制的质粒载体。
11
pPIC9k质粒图谱
依森泰德（Exenatide）是首个合成肠促胰岛素类似物，具 有多种降血糖作用。HAS：人血清白蛋白
Exenatide
Twice a day
2.4h被代谢
Exenatide
HSA
PCR 基因重组
Exenatide
HSA
Once a week
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毕赤酵母表达外源蛋白示例
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谢谢大家！！
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Mut表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型
Mut+ 存在
存在
正表型
Muts 缺失
存在
缓慢型
Mut- 缺失
缺失
负型
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选择过程
HIS4缺陷培养基
导入质粒
G418酵母培养基
低
高
G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性
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发酵过程
巴斯德毕赤酵母表达系统
报告人：彭平平
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起源及背景
• 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是8O年 代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
• 30年前Koichi Ogata首次发现有些酵母可以利用 甲醇为唯一的碳源和能源.
• 70年代Philips pertoleum公司就开发出高密度连 续发酵生产毕赤酵母的工艺(细胞干重130g/L)。
• AOX--醇氧化酶 • S --- 分泌信号
• MCS –多克隆位点 • TT---终止信号
• HIS4--组氨醇脱氢酶 • Kanamycin---抗卡拉霉素基因 • pBR322---大肠杆菌的复制起始位点 • Ampicillin---抗氨苄青霉素基因
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外源蛋白的引入表达
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菌株类型
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结构特点
一、单细胞微生物 1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、
折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
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二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降 解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H202对细胞的毒害。
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4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3 连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用 于临床应用
6、使用方便、简单，而且成本较低
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毕赤酵母与其它表达系统相比 有许多优点
1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度 生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从 而进行高效表达
2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构 稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合 到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株
3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基 因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达