分子排阻色谱法(测定多糖分子量及其分布)--梁翠荣(精)

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色谱柱的选用
亲水性球型高聚物为填充剂 （TSK G PWXL柱, Shodex OHpak SB HQ柱）
右旋糖酐铁 右旋糖酐20 右旋糖酐40 右旋糖酐70 TSK G2500 PWXL TSK G3000 PWXL TSK G4000 PWXL TSK G4000 PWXL
Hale Waihona Puke Baidu
检测系统
多糖的检测，最常用的检测器为示差折光检测器 （通用型检测器）。通过连续地测定淋出液折光指数 的变化来测定样品的浓度，只要溶剂的折光指数与被 测样品的折光指数有区别均能检测。
色谱柱
各种色谱柱的孔隙大小分布有一定范围，有最大 极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的， 就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。 两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。 直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔 隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们 的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，色谱 柱有一定的使用范围。
分子排阻色谱法
测定多糖分子量及其分布
分离原理
凝胶渗透色谱 Gel Permeation Chromatography GPC
也称体积排阻色谱 Size Exclusion Chromatography SEC
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行 的路径有颗粒间的间隙（较大）和颗粒内的微孔（较小）。当聚合物溶液流经色 谱柱时，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒 之间，所以在洗脱时移动的速度较快（即保留时间短）；小分子物质除了可在凝 胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，洗脱时移动的速度要慢得多 （即保留时间长）。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子大小被分开，这 种现象叫分子筛效应。
右旋糖酐分子量D1 M 2500 ； 右旋糖酐分子量D2 M 4600 ； 右旋糖酐分子量D3 M 7100； 右旋糖酐分子量D4 M 10000； 右旋糖酐分子量D5 M 21400；右旋糖酐分子量D6 M 41100 ； 右旋糖酐分子量D7 M 84400； 右旋糖酐分子量D8 M 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 2000000
测定方法

直接法：在测定淋出液浓度的同时，测定其粘 度或光散射，从而求出其分子量。 间接法：用一组分子量不等的、单分散的试样 为标准样品，分别测定它们的淋出体积（保留 时间），建立保留时间与分子量二者之间的关 系，从而求出其分子量。

间接法
右旋糖酐分子量对照品（ 供右旋糖酐分子量测定用 中检所）



注意事项

1.在连接色谱柱之前，应该预先用即将使用的流动相置换以前用过的流 动相，注意控制流动相的流速，别超压（适用的压力范围说明书上很详 细）。 2.与常规的HPLC法相同，使用时流动相和样品过滤干净。


3.色谱柱用后用水冲洗，连接的检测器也要冲洗。绝对不能让盐保存在 检测器的池子里，否则一旦池子里的流动相挥发，盐会沉积在池子的表 面。池子污染后，再处理清洗是很麻烦的。 4.用0.05%叠氮化钠水溶液冲洗色谱柱，主要是为了防止长菌而影响柱 效。
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物做一条 淋洗体积或淋洗时间和相对分子量对应关系曲线，称 为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准 样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下， 做一系列的GPC标准谱图，以重均分子量的对数值 (lgM)对保留时间(t)作图，所得曲线即为“校正曲线”。 通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对 分子量与相对分子量分布的信息。
测定方法


色谱条件与系统适用性试验 TSK G PWXL柱 柱温35℃ 进样量20μl 流动相：0.71%硫酸钠溶液(内含0.02%叠氮化钠) 0.5ml/min 取葡萄糖和葡聚糖2000，分别加流动相制成10mg/ml 的溶液，进样,测得保 留时间tT和t0，对照品溶液和供试品溶液的保留时间均应在tT和t0之间，理论板 数按葡萄糖峰计算不小于5000。 对照品溶液：取右旋糖酐分子量对照品(中检所) 适量，分别加流动相制成 10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 供试品溶液： 取供试品适量，加流动相制成10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 测定法：取对照品溶液，进样，用GPC软件计算回归方程。取供试品溶液， 同法测定，用GPC软件算出供试品的重均分子量及分子量分布。