实验模式动物--斑马鱼
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14
斑马鱼在药物评价中的应用
1.一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼 鱼、成鱼的各个阶段进行,相应的观察指标略有不同。在 胚胎期,在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体节形 成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等。 幼鱼和成鱼主要是统计LC50、死亡率等。 2.发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中,很多器官 系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的,比如脑、心 血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏,极易导致 畸形的产生,是评价药物致畸性的有效模型之一。
19
采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒 性
1.主要试剂：雷公藤甲素( tripto lide) , 中国医学 科学院协和医科大学皮肤病研究所(江苏, 南京) 惠赠,纯度大于98% . 大黄素( emod in) , 瑞雷植 化制剂厂提供, 含量98%. 苦参碱( matrine), 江 苏天晟药业有限公司产品, 含量98%. DMSO 为 S igma公司产品(美国)。超纯水取自M illipore 超纯水机。
15
斑马鱼在药物评价中源自文库应用
3.心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥 作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚胎 和幼鱼的透明性,无需借助遥测或其他技术就可以实时观 察心跳、心脏的收缩性、血液循环,非常的便利。 4.肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业一个主要的 毒理学问题。目前,应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终点 主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素P450和组织病 理学变化。
Chuck Kimmel
3
斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注 Turn Eyes to Fish
• Christiane Nü sslein-Volhard
Wolfgang Driever
• 1995 诺贝尔奖获得者
was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments, turned eyes to fish and find a wide range of mutations
16
斑马鱼在药物评价中的应用
5.神经毒性评价：斑马鱼胚胎在24hpf原代神经元细胞开始 分化,48hpf脑室形成,在6dPf所有的神经系统形成,斑马 鱼可在短时间呈现整个神经系统,可作为一个有机载体, 建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。 6.肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球 和前肾小管组成,较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物肾 中毒,其表型在斑马鱼原肾上也可看到,既肾小球滤过率 降低。尽管结构的复杂程度不一样,但是在肾损伤表型方 面却是保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体,能为药 物在临床上的应用提供重要的参考价值。
实验模式动物—斑马鱼
Use Zebrafish AS A Model Organism
生药学 张彩
1
汇报内容
• 斑马鱼概况
• 斑马鱼作为模式生物的优点 • 斑马鱼在药物的评价中的应用 • 采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性 毒性
2
第一部分
概
况
• 70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被 详细研究：在位于Eugene 的 俄勒冈大学， Charles Kimmel 及其同事开始将斑马鱼作为 研究发育的动物模型，并探索其作用。
11
斑马鱼的心脏再生 Heart Regeneration in Zebrafish
• 斑马鱼的Mps1 mitotic checkpoint kinase是 一个至关重要的细胞周期调节因子，如发 生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形 成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细 胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。 这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分 子机制方面起重要作用。
17
斑马鱼在药物评价中的应用
7.胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着 千差万别,斑马鱼没有胃,肠道直接开始于咽部下的一小 段食道之后。在发育的早期肠道就开始蠕动,在未喂食时 就自发的游走性蠕动,由于幼鱼是透明的,这些蠕动清晰 可见。 8. 视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜,有 色彩视觉,这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物。 同时,斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速,幼鱼就展示了视 觉介导的行为,故可用于评价化合物对视觉的影响。
20
2.方法：实验前一天禁食。取成体斑马鱼分别臵 于含有30~ 50mL溶液的瓶中, 保持瓶中溶液温 度恒定在25℃，随机分为空白对照, 溶剂对照及 各药物浓度给药组, 每组含15条。分别给予纯净 水, 含不同浓度药物的纯净水。
记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数量 (只), 计算死亡率(% )。根据实验结果, 采用Bliss 法计算LC50值。
5 days
2.5 days
6 days
3 days
7 days
10
斑马鱼的骨骼发育
缺少chordin表达的斑 马鱼的BMP蛋白水平 异常，鳍和尾部骨架 也异常—注射chordin mRNA后可恢复。因 此研究者使用斑马鱼 的这项特性来进行基 因筛查，以确定脊椎 动物骨骼形成的调节 机制。
—Rik Derynck Nature Genetics ,1999
18
斑马鱼在药物评价中的应用
9.耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就 相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至尾排列, 胚胎时期在光镜下清楚可见,有助于药物作用下,观察其 形态和功能变化。 10.软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似,颅面骨骼 都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细 胞,并布满血管,受神经支配。
21
3.结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马 鱼的LC50值依次为5.02 x10-3、113.2和1.18 x103 ug /mL, 毒性大小顺序与文献报道基本一 致。
22
23
4
斑马鱼基本特性
• 产于热带印度，孟加拉国。 • 成鱼体长4～6厘米。体呈纺锤形。雌雄易 区分。 • 性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。 • 属卵生鱼类 ，4月龄进入性成熟期。繁殖期 约7天左右。产卵量高，繁殖力很强 。 • 体外受精，胚胎透明，在24小时内就可发 育成形， 2~3天孵出仔鱼 。
12
心脏切除后心室肌的再生
Regeneration of ventricular myocardium in the resected zebrafish heart
13 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE
13
斑马鱼在药物评价中的应用
1.一般毒性评价 2.发育毒性评价 3.心血管毒性评价 4.肝脏毒性评价 5.神经毒性评价 6.肾毒性评价 7.肠胃毒性评价 8.视觉毒性评价 9.耳毒性评价 10.软骨毒性评价
8
心血管系统发育 Development of Zebrafish Vascular System
Nature Medicine, 1995
9
Development of Zebrafish Vascular System
28 hours 3.5 days
1.5 days
4.5 days
2 days
5
斑马鱼的繁殖
♀
♂
6
斑马鱼胚胎早期发育图谱
7
斑马鱼作为模式生物的优点
1.斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身 上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因 此它受到生物学家的重视。
2.斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其 体内器官的影响。 3.此外，雌性斑马鱼可产卵数百枚，胚胎在24小时内就可发育 成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验， 进而研究病理演化过程并找到病因。
斑马鱼在药物评价中的应用
1.一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼 鱼、成鱼的各个阶段进行,相应的观察指标略有不同。在 胚胎期,在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体节形 成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等。 幼鱼和成鱼主要是统计LC50、死亡率等。 2.发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中,很多器官 系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的,比如脑、心 血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏,极易导致 畸形的产生,是评价药物致畸性的有效模型之一。
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采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒 性
1.主要试剂：雷公藤甲素( tripto lide) , 中国医学 科学院协和医科大学皮肤病研究所(江苏, 南京) 惠赠,纯度大于98% . 大黄素( emod in) , 瑞雷植 化制剂厂提供, 含量98%. 苦参碱( matrine), 江 苏天晟药业有限公司产品, 含量98%. DMSO 为 S igma公司产品(美国)。超纯水取自M illipore 超纯水机。
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斑马鱼在药物评价中源自文库应用
3.心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥 作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚胎 和幼鱼的透明性,无需借助遥测或其他技术就可以实时观 察心跳、心脏的收缩性、血液循环,非常的便利。 4.肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业一个主要的 毒理学问题。目前,应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终点 主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素P450和组织病 理学变化。
Chuck Kimmel
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斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注 Turn Eyes to Fish
• Christiane Nü sslein-Volhard
Wolfgang Driever
• 1995 诺贝尔奖获得者
was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments, turned eyes to fish and find a wide range of mutations
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斑马鱼在药物评价中的应用
5.神经毒性评价：斑马鱼胚胎在24hpf原代神经元细胞开始 分化,48hpf脑室形成,在6dPf所有的神经系统形成,斑马 鱼可在短时间呈现整个神经系统,可作为一个有机载体, 建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。 6.肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球 和前肾小管组成,较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物肾 中毒,其表型在斑马鱼原肾上也可看到,既肾小球滤过率 降低。尽管结构的复杂程度不一样,但是在肾损伤表型方 面却是保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体,能为药 物在临床上的应用提供重要的参考价值。
实验模式动物—斑马鱼
Use Zebrafish AS A Model Organism
生药学 张彩
1
汇报内容
• 斑马鱼概况
• 斑马鱼作为模式生物的优点 • 斑马鱼在药物的评价中的应用 • 采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性 毒性
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第一部分
概
况
• 70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被 详细研究：在位于Eugene 的 俄勒冈大学， Charles Kimmel 及其同事开始将斑马鱼作为 研究发育的动物模型，并探索其作用。
11
斑马鱼的心脏再生 Heart Regeneration in Zebrafish
• 斑马鱼的Mps1 mitotic checkpoint kinase是 一个至关重要的细胞周期调节因子，如发 生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形 成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细 胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。 这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分 子机制方面起重要作用。
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斑马鱼在药物评价中的应用
7.胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着 千差万别,斑马鱼没有胃,肠道直接开始于咽部下的一小 段食道之后。在发育的早期肠道就开始蠕动,在未喂食时 就自发的游走性蠕动,由于幼鱼是透明的,这些蠕动清晰 可见。 8. 视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜,有 色彩视觉,这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物。 同时,斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速,幼鱼就展示了视 觉介导的行为,故可用于评价化合物对视觉的影响。
20
2.方法：实验前一天禁食。取成体斑马鱼分别臵 于含有30~ 50mL溶液的瓶中, 保持瓶中溶液温 度恒定在25℃，随机分为空白对照, 溶剂对照及 各药物浓度给药组, 每组含15条。分别给予纯净 水, 含不同浓度药物的纯净水。
记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数量 (只), 计算死亡率(% )。根据实验结果, 采用Bliss 法计算LC50值。
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2.5 days
6 days
3 days
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10
斑马鱼的骨骼发育
缺少chordin表达的斑 马鱼的BMP蛋白水平 异常，鳍和尾部骨架 也异常—注射chordin mRNA后可恢复。因 此研究者使用斑马鱼 的这项特性来进行基 因筛查，以确定脊椎 动物骨骼形成的调节 机制。
—Rik Derynck Nature Genetics ,1999
18
斑马鱼在药物评价中的应用
9.耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就 相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至尾排列, 胚胎时期在光镜下清楚可见,有助于药物作用下,观察其 形态和功能变化。 10.软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似,颅面骨骼 都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细 胞,并布满血管,受神经支配。
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3.结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马 鱼的LC50值依次为5.02 x10-3、113.2和1.18 x103 ug /mL, 毒性大小顺序与文献报道基本一 致。
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斑马鱼基本特性
• 产于热带印度，孟加拉国。 • 成鱼体长4～6厘米。体呈纺锤形。雌雄易 区分。 • 性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。 • 属卵生鱼类 ，4月龄进入性成熟期。繁殖期 约7天左右。产卵量高，繁殖力很强 。 • 体外受精，胚胎透明，在24小时内就可发 育成形， 2~3天孵出仔鱼 。
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心脏切除后心室肌的再生
Regeneration of ventricular myocardium in the resected zebrafish heart
13 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE
13
斑马鱼在药物评价中的应用
1.一般毒性评价 2.发育毒性评价 3.心血管毒性评价 4.肝脏毒性评价 5.神经毒性评价 6.肾毒性评价 7.肠胃毒性评价 8.视觉毒性评价 9.耳毒性评价 10.软骨毒性评价
8
心血管系统发育 Development of Zebrafish Vascular System
Nature Medicine, 1995
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Development of Zebrafish Vascular System
28 hours 3.5 days
1.5 days
4.5 days
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斑马鱼的繁殖
♀
♂
6
斑马鱼胚胎早期发育图谱
7
斑马鱼作为模式生物的优点
1.斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身 上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因 此它受到生物学家的重视。
2.斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其 体内器官的影响。 3.此外，雌性斑马鱼可产卵数百枚，胚胎在24小时内就可发育 成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验， 进而研究病理演化过程并找到病因。