2019年规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象.doc
基于质谱的蛋白质鉴定，第4节：基于MALDI-MS-PSD的多肽序列分析
基于质谱的蛋白质鉴定，第4节：基于MALDI-MS-PSD的多肽序列分析尽管MALDI原则上是一种软电离技术，几乎只产生完整的生物分子离子，但MALDI在电离过程中会形成相当程度的亚稳态离子。
对于肽和蛋白质离子，这种亚稳定的离子行为不仅会引起中性小分子（如水和氨）的损失，还会引起多种肽键断裂。
MALDI-MS中有两种不同类型的碎片反应：（i）在激光撞击后几百ns内，质谱仪的离子源附件的离子的“迅速碎片” （prompt fragmentation）和（ii）PSD则需要较长一些的时间（μs），在将来源于MALDI的离子从离子源提取到RETOF质谱仪的第一个无电场区域的过程。
一般认为，分析物离子在萃取过程中的碰撞激活，以及在电离过程后能量过剩的离子的单分子衰变，都被认为是造成PSD现象的原因。
由于PSD发生在无电场区域，碎片离子的速度与其完整的母离子保持相同的速度，因此在线性MALDI-MS光谱中不能被观察到。
可以通过用一个静电离子镜或“场电子场”代替无场区末端的检测器，这会颠倒入射离子的飞行路径，碎片离子就可以从其完整的母离子中分离出来。
由于它们的动能较小，它们不像完整离子那样深入反射层，因此会更早地从该场中弹出，并且在MALDI-RETOF-MS光谱中的表观质量会低于其前体离子。
由于大多数反射电子场在给定的电压设置下仅具有有限的动态分离范围，因此需要将其逐步降低到较低的电压，以便分离和聚焦整个目标碎片质量范围（通常可以获得10-15个片段）。
一旦反射电子场通过人工合成的已知肽段进行了校准，即可将片段光谱胶合在一起以形成PSD光谱，这时所有片段离子的质量都可以确定。
也可以使用弯曲场反射器，将场几何（field geometry）同时应有于分离和聚焦产生的所有碎片离子，从而避免使用单级或双级反射器的耗时的电压渐进过程。
通过研究肽离子的MALDI-PSD片段，可以推测PSD是酰胺键断裂的主要结果，非常类似于低能碰撞活化解离（CAD）诱导的肽的片段化行为。
蛋白质修饰检测技术及其应用
蛋白质修饰检测技术及其应用蛋白质修饰是指在翻译后修饰成熟的蛋白质分子上发生的各种化学改变。
蛋白质修饰可以调节蛋白质的结构、功能和活性，对维持细胞的正常生理功能至关重要。
因此，研究蛋白质修饰及其应用于疾病诊断、治疗和药物研发成为了当前的热点研究领域。
本文将介绍蛋白质修饰的检测技术及其在生物医学领域的应用。
一、蛋白质修饰的类型1. 磷酸化修饰：蛋白质磷酸化是目前研究最广泛的一种修饰形式。
它通过添加磷酸基团改变蛋白质的电荷和空间构型，从而影响蛋白质的功能。
常用的磷酸化修饰检测方法包括质谱分析、免疫印迹和蛋白质芯片技术。
2. 甲基化修饰：蛋白质甲基化是通过向蛋白质上的氮、氧或硫原子添加甲基基团而实现的修饰。
甲基化修饰可以调节蛋白质的稳定性、活性和亲和性。
常用的甲基化修饰检测方法有质谱分析、甲基化特异性抗体和免疫荧光染色。
3. 乙酰化修饰：蛋白质乙酰化是通过向蛋白质上的赖氨酸残基添加乙酰基团而实现的修饰。
乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、转录活性和DNA结合能力。
常用的乙酰化修饰检测方法包括质谱分析、乙酰化特异性抗体和酶活性检测。
二、蛋白质修饰检测技术1. 质谱分析：质谱分析是目前最常用的蛋白质修饰检测方法之一。
它通过测量蛋白质分子的质量和质荷比，可以鉴定和定量各种蛋白质修饰形式。
质谱分析的优点是高灵敏度和高分辨率，能够识别极低浓度的修饰产物。
2. 免疫印迹：免疫印迹是一种常用的蛋白质修饰检测技术，它利用特定抗体与目标修饰蛋白发生特异性结合，然后通过化学荧光或酶标记来检测修饰的蛋白质。
免疫印迹技术操作简便，可以同时检测多个修饰位点。
3. 蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质修饰检测技术。
它将多个蛋白质修饰位点的抗体固定在芯片上，然后通过与样品中的修饰蛋白发生特异性结合来进行检测。
蛋白质芯片技术可以同时检测大量的修饰位点，适用于高通量筛查和研究。
三、蛋白质修饰的应用1. 疾病诊断：蛋白质修饰在疾病诊断中发挥着重要作用。
蛋白质氧化修饰
蛋白质氧化修饰一、概述蛋白质氧化修饰是指蛋白质分子中的氨基酸残基被氧化成为不同的功能性群，如醛基、羧酸、巯基氧化等。
这种修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响细胞内许多生物学过程。
在生理和病理状态下，蛋白质氧化修饰是一种常见的现象。
二、蛋白质氧化修饰类型1. 巯基氧化巯基是由半胱氨酸残基组成的一种硫含量高的官能团。
在细胞内，巯基容易受到各种自由基和其他活性分子的攻击，导致其被氧化成为半胱二硫桥（Cys-S-S-Cys）或半胱磺酸（Cys-SO3H）。
这些修饰会影响蛋白质的结构和功能。
2. 醛基化当细胞内产生过量的自由基时，会导致脂肪过氧化反应发生，并生成大量的α,β-不饱和醛类物质。
这些物质可以与蛋白质中的氨基酸残基发生反应，形成醛基化产物，如羟乙醛、丙酮、甲醛等。
这些修饰会影响蛋白质的结构和功能。
3. 羧基化羧基化是指蛋白质中的谷氨酸和天冬氨酸残基被氧化成为羧酸，这种修饰可以导致蛋白质的电荷分布发生变化，从而影响其结构和功能。
4. 氧化还原修饰氧化还原修饰是指蛋白质中的半胱氨酸残基被还原或氧化，从而影响蛋白质的结构和功能。
在细胞内，半胱氨酸可以通过形成二硫键来稳定蛋白质的结构。
当二硫键被还原或氧化时，会导致蛋白质结构发生变化。
三、蛋白质氧化修饰与疾病1. 心血管疾病心血管疾病是由于动脉粥样硬化引起的一系列疾病，包括冠心病、心肌梗死、中风等。
研究表明，蛋白质氧化修饰在心血管疾病的发生和发展中起着重要的作用。
例如，低密度脂蛋白（LDL）被氧化后可以诱导动脉粥样硬化的形成。
2. 神经退行性疾病神经退行性疾病是由于神经细胞受到损伤或死亡引起的一系列疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森氏症等。
近年来的研究表明，蛋白质氧化修饰在神经退行性疾病的发生和发展中也起着重要的作用。
例如，阿尔茨海默病患者大脑中的β淀粉样蛋白被氧化后可以导致神经元死亡。
3. 肿瘤肿瘤是由于细胞异常增殖引起的一系列恶性肿瘤。
最近的一些研究表明，蛋白质氧化修饰在肿瘤的发生和发展中也起着重要的作用。
_自顶向下_top_down_的蛋白质组学_蛋白质变体的规模化鉴定_孙瑞祥
鉴定到的肽段同时匹配上几个高度同源的蛋白质时 就无法确定哪些蛋白质是真实存在的，这样的现象 在人类蛋白质中大量存在[17]．以完整蛋白质为研究 对象的“自顶向下”的蛋白质组学，为解决这个问 题提供了新的思路和技术实现的可能，这主要也是 源自最近几年内质谱技术的快速发展．
早期的质谱技术主要用途是测量元素的同位 素，之后出现了可以测量小分子的质谱．20 世纪 80 年 代 末 电 喷 雾 离 子 化 (electro-spray ionization， ESI) 与 基 质 辅 助 激 光 解 吸 附 离 子 化 (matrix-assisted laser desorption and ionization，MALDI)两项软电离 技术的发明，使得质谱技术可以在测量生物大分子 上得到广泛的应用，以肽段为中心的质谱分析已经 成为当前蛋白质鉴定的常规手段．随着高分辨率质 谱技术越来越成熟，直接测量完整蛋白质的分子质 量与蛋白质的碎裂谱成为可能．质谱技术的发展还 可以直接测量蛋白质复合体的质谱．从上述质谱技 术的发展过程来看，可测量的对象由小逐渐变大， 从元素到小分子，从肽段到蛋白质，再到蛋白质的 复合体，这反映出了质谱技术发展的趋势，同时也 反映出了蛋白质研究的技术需求．
蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价
蛋白质工程部氨基酸测序及其蛋白质质量评价2.深圳亚辉龙生物科技股份有限公司，广东深圳518000【摘要】氨基酸序列是蛋白质和多肽重要的结构，其决定蛋白质的高级结构。
氨基酸测序在蛋白质研究中越发重要，高分辨率质谱技术的发展大大促进了氨基酸测序的研究。
本文综述了氨基酸测序的方法、原理以及其应用的研究进展，随着质谱技术的不断发展，新的测序方法不断建立，氨基酸测序将在蛋白质研究中发挥更大的作用。
【关键词】蛋白质；氨基酸测序；质谱技术；从头测序蛋白质是一类最重要的生物大分子，在生物体内占有特殊的地位。
其一级结构是由多肽链主链上共价连接的氨基酸残基决定的，二级结构和其它高级结构主要是由非共价力如氢键、离子键、范德华力和疏水作用决定的。
一级结构中氨基酸序列的排列决定蛋白质高级结构的生物学活性。
因此，氨基酸序列测定具有非常重要的意义。
氨基酸序列测定一般需要测定其相对分子质量、等电点、N-末端肽段序列和C-末端肽段序列，虽然测定每种蛋白质的氨基酸序列都有自己特殊的问题需要解决，但是氨基酸测定的一般方法都可以概括为：①测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据蛋白质N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可以确定蛋白质分子中的多肽数目；②拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链间的二硫键，如果蛋白质分子是由一条以上多肽链构成的，则这些链必须加以拆分；③鉴定多肽链的N-末端残基和C-末端残基，裂解多肽链成较小的片段，测定各肽段的氨基酸序列，目前最常用的肽段测序方法有Edman降解法[1]、酶解法和质谱法；④运用软件重建完整多肽链的一级结构，确定二硫键的位置，利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间交错拼凑出完整多肽链的氨基酸测序。
目前氨基酸序列测定的方法主要有化学降解法、酶降解法和质谱法以及核苷酸序列的推定法，每种方法都有其自身的优势和劣势，以前面三种测序方法最为常用。
1化学降解法化学降解法是指蛋白质或多肽物质与相应的化学试剂反应后，专一裂解多肽链肽段并检测相关裂解片段的方法，包括N-末端肽段序列测定法和C-末端肽段序列测定法。
酶切过程中肽段过烷基化对蛋白质定性和定量分析的影响
酶切过程中肽段过烷基化对蛋白质定性和定量分析的影响王继峰;赵新元;赵焱;马成;钟儒刚;钱小红;应万涛【摘要】蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应.我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况.结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸＞肽段N 端氨基酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞组氨酸＞天冬酰胺＞赖氨酸＞酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性.根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响.该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响.在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2013(031)010【总页数】7页(P927-933)【关键词】液相色谱;质谱;多反应监测;蛋白质组学;烷基化;碘乙酰胺【作者】王继峰;赵新元;赵焱;马成;钟儒刚;钱小红;应万涛【作者单位】北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022;北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100022;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206【正文语种】中文【中图分类】O658近几年蛋白质组学迅猛发展，逐步渗入到生命科学的各个领域，并且由大规模的定性分析，向高通量、目标化、准确的定量分析发展。
蛋白质胰蛋白酶水解过程双位点漏切肽段的质谱鉴定
蛋白质胰蛋白酶水解过程双位点漏切肽段的质谱鉴定王勇;李水明;何曼文;邹永东【期刊名称】《质谱学报》【年(卷),期】2013(034)001【摘要】为说明胰蛋白酶漏切位点数目设置对蛋白质搜库结果的影响,采用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了细胞色素C和大豆脱落胁迫成熟蛋白.在细胞色素C和大豆脱落胁迫成熟蛋白的胰酶水解液中分别发现了2个和4个双胰酶漏切位点肽段,确认了文献中报道的当赖氨酸和赖氨酸相邻或赖氨酸、精氨酸各自与天冬氨酸或者谷氨酸相邻时,会引起胰蛋白酶的漏切.此外,还发现组氨酸-赖氨酸-异亮氨酸/丙氨酸结构也有此现象.本研究中检测出漏切肽段并没有明显提高序列覆盖率,但显著增加了蛋白质鉴定结果的确定性.在实际样品分析中如将漏切数设置为1有可能产生肽段鉴定的假阴性.【总页数】6页(P29-34)【作者】王勇;李水明;何曼文;邹永东【作者单位】深圳大学生命科学学院,深圳市微生物基因工程重点实验室,广东深圳518060【正文语种】中文【中图分类】O657.63【相关文献】1.规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象 [J], 卢庄;赵丽艳;张养军;蔡耘;邓玉林;张玉奎;钱小红2.一种位点注释的蛋白质数据库用于磷酸化肽段的鉴定 [J], 程凯;王方军;边阳阳;叶明亮;邹汉法3.酶切过程中肽段过烷基化对蛋白质定性和定量分析的影响 [J], 王继峰;赵新元;赵焱;马成;钟儒刚;钱小红;应万涛4.基于深度学习与领域规则建模的蛋白质信号肽及其切割位点预测 [J], 张维洵;潘小勇;沈红斌5.辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽 [J], 施娅楠;张家艳;黄艾祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
蛋白质翻译后修饰——末端修饰(氨基末端、羧基末端)——加密版
蛋白质翻译后修饰——末端修饰（氨基末端、羧基末端）（~~by luckyboy）（微生物班、精简打印、元旦巨献版）在核糖体上翻译的时候，当氨基酸添加到新生多肽之后，在体内氨基酸残基会发生各种各样的共价修饰。
I、氨基端的修饰初生蛋白的第一个氨基酸的命运：在细菌中：在细菌中生物合成蛋白质的第一步一般是甲酰甲硫氨酰-tRNAfmet和第二个氨酰tRNA通过肽键合成，因此初生蛋白质存在一个甲酰甲硫氨酰位点。
在真核生物中：虽然N末端甲硫氨酰位点从第一个甲硫氨酸获取在成熟蛋白质中很常见，N末端的α-甲基一般很快会被移除，接着在大多数情况下甲硫氨酸残基会被断裂下来。
这个作用是依靠甲硫氨酸氨基肽酶的作用，并且这个裂解过程由第二个残基控制。
（1）在酵母中（啤酒酵母）：如果倒数第二个氨基酸残基有一个0.129nm或更小的回转半径的时候，甲硫氨酸会被完完全全的裂解掉（这些氨基酸有：Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro, Val）（3）在真菌或哺乳动物的线粒体中：起始甲硫氨酸的不被去除，但在植物的线粒体中还是会发生的。
在工程菌中：在大肠杆菌中过量表达的蛋白质通过质粒技术会导致一种甲硫氨酸残基保留的不正常现象。
一、乙酰化1．N端a-乙酰基修饰（a-acetyl）在蛋白质中是很普遍的在Ehrlich ascite 细胞中：大概有80%的可溶蛋白是N端a-乙酰基修饰的。
在高等真核生物中：有证据表明在这些细胞中氨基酸末端乙酰化是非常普遍的，几乎可以作为高等真核生物蛋白质的一个典型标志。
在低等真核生物中：N端a-乙酰基的比例比较低，但还是存在的2. N端a-乙酰基化修饰通常是翻译中同时发生的，一般发生在新生肽链大约40个残基长的时候3.N端残基乙酰化修饰的频率（概率）是不同的：一般Ala,Ser > Met,Gly, Asp > Asn,lle,Thr,Val > 其他氨基酸残基（1）在高等真核生物中的蛋白质比细菌或真菌中的蛋白质更可能发生乙酰基修饰（2）在大肠杆菌中表达的真核细胞蛋白部分发生乙酰化。
2.蛋白质翻译后修饰-----末端修饰
蛋白质翻译后修饰——末端修饰（氨基末端、羧基末端）2010 遗传学在核糖体上翻译的时候，当氨基酸添加到新生多肽之后，在体内氨基酸残基会发生各种各样的共价修饰。
I、氨基端的修饰初生蛋白的第一个氨基酸的命运：在细菌中：在细菌中生物合成蛋白质的第一步一般是甲酰甲硫氨酰-tRNAf met和第二个氨酰tRNA通过肽键合成，因此初生蛋白质存在一个甲酰甲硫氨酰位点。
在真核生物中：虽然N末端甲硫氨酰位点从第一个甲硫氨酸获取在成熟蛋白质中很常见，N末端的α-甲基一般很快会被移除，接着在大多数情况下甲硫氨酸残基会被断裂下来。
这个作用是依靠甲硫氨酸氨基肽酶的作用，并且这个裂解过程由第二个残基控制。
1）在酵母中（啤酒酵母）：如果倒数第二个氨基酸残基有一个0.129nm或更小的回转半径的时候，甲硫氨酸会被完完全全的裂解掉（这些氨基酸有：Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro, Val）2）在真菌或哺乳动物的线粒体中：起始的甲硫氨酸不被去除，但在植物的线粒体中还是会发生的。
在工程菌中：在大肠杆菌中过量表达的蛋白质通过质粒技术会导致一种甲硫氨酸残基保留的不正常现象。
一、乙酰化1.N端α-乙酰基修饰（α-acetyl）在蛋白质中是很普遍的在Ehrlich ascite 细胞中：大概有80%的可溶蛋白是N端α-乙酰基修饰的。
在高等真核生物中：有证据表明在这些细胞中氨基酸末端乙酰化是非常普遍的，几乎可以作为高等真核生物蛋白质的一个典型标志。
在低等真核生物中：N端α-乙酰基的比例比较低，但还是存在的2.N端α-乙酰基化修饰通常是翻译中同时发生的，一般发生在新生肽链大约20-50个残基长的时候3.N端残基乙酰化修饰的频率（概率）是不同的：一般Ala,Ser > Met,Gly, Asp > Asn,lle,Thr,Val > 其他氨基酸残基（1）在高等真核生物中的蛋白质比细菌或真菌中的蛋白质更可能发生乙酰基修饰（2）在大肠杆菌中表达的真核细胞蛋白部分发生乙酰化。
LT-3 蛋白质化学 生物化学习题汇编
目录第三章蛋白质化学 (2)一、填充题 (2)二、是非题 (6)三、选择题 (8)四、问答题 (16)五、计算题 (24)第三章蛋白质化学一、填充题1、氨基酸的结构通式为( )。
2、组成蛋白质分子的碱性氨基酸有( )、( )和( )。
酸性氨基酸有( )和( )。
3、在下列空格中填入合适的氨基酸名称。
(1)( )是带芳香族侧链的极性氨基酸。
(2)( )和( )是带芳香族侧链的非极性氨基酸。
(3)( )是含硫的极性氨基酸。
(4)( )或( )是相对分子质量小且不含硫的氨基酸，在一个肽链折叠的蛋白质中它能形成内部氢键。
(5)在一些酶的活性中心中起重要作用并含羟基的极性较小的氨基酸是( )。
4、Henderson-Hasselbalch方程为( )。
5、氨基酸的等电点(p I)是指( )。
6、氨基酸在等电点时，主要以( )离子形式存在，在pH >pI的溶液中，大部分以( )离子形式存在，在pH ＜pI的溶液中，大部分以( )离子形式存在。
7、在生理条件下( pH 7.0 左右)，蛋白质分子中的( )侧链和( )侧链几乎完全带正电荷，但是( )侧链则带部分正电荷。
8、脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生( )色的物质，而其他氨基酸与茚三酮反应产生( )色的物质。
9、范斯莱克(Van Slyke)法测定氨基氮主要利用( )与( )作用生成( )。
10、实验室常用的甲醛滴定是利用氨基酸的氨基与中性甲醛反应，然后用碱(NaOH)来滴定( )上放出的( )。
11、通常可用紫外分光光度法测定蛋白质的含量，这是因为蛋白质分子中的( )、( )和( )三种氨基酸的共轭双键有紫外吸收能力。
12、寡肽通常是指由( )个到( )个氨基酸组成的肽。
13、肽链的形式有( )、( )和( )三种，其中以( )最常见。
14、在一些天然肽中含有( )、( )和( )等特殊结构。
这些结构在蛋白质中是不存在的。
很可能这些结构上的变化可使这些肽免受蛋白水解酶的作用。
蛋白质分析课件
蛋白质的快速测定－双缩脲法
原理
《蛋白质分析》PPT课件
方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品的测定。也可定量测定分离 纯化后的蛋白质。
《蛋白质分析》PPT课件
步骤
标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白 质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含 量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、 100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四 氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确 稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上 层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于 比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液 调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋 白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制 标准曲线。
《蛋白质分析》PPT课件
四、紫外吸收法
原理 蛋白质在UV280nm处有强烈吸收，这是由 于蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环 残基存在。由于存在于每一种食品的蛋 白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定， 所以可用比色法，即在280nm处比色测定 蛋白质的浓度。
《蛋白质分析》PPT课件
适用范围
应用 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于 许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故 还没有广泛应用于食品体系。 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量， 但此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提 在碱液或变性剂（如8M尿素）中的蛋白质测定。 尽管蛋白质中的肽键在190nm~220nm处的紫 外吸收比在280nm更强，但在低紫外区域的 测定更困难。
蛋白质、多肽修饰中的PEG化学
蛋白质、多肽修饰中的PEG化学背景PEG修饰是一个使多肽或蛋白质在治疗或生物技术方面的效力得以提高的重要过程。
当PEG以适当的方式连接在蛋白质或多肽上时，它能改变许多的特征，而主要的生物活性功能，如酶活性或特异结合位点，可以保留下来。
PEG修饰通过如下几种途径改善药物的性能。
首先，PEG连接在蛋白质或多肽的表面上，提高了它的分子大小，并且它还能携带大量的水分子，一种PEG-蛋白质因而增大了5～10倍。
其次，PEG修饰使得以前不溶的蛋白质不仅容易溶解，而且具有高度移动性。
此外，PEG修饰可以减少肾脏对药物的滤过作用，降低它的致热原性，还可以减少蛋白酶对其的消解，通过保护分子免受人体免疫系统的攻击来改善了它的输送。
同时，因为它逃避了人体防御机构，因而在作用部位停留的时间就长得多，并使局部药物浓度增高。
目前在国外上市的PEG-多肽(或PEG-蛋白质)产品有：Schering-Plough公司的PEG-Intron，于2001年1月22日由FDA批准上市。
它采用了Enzon公司开发的专利PEG技术。
这种重组干扰素α-2b与一个12,000 dalton PEG分子连接，使其抗病毒活性和消除半衰期之间达到最佳平衡。
Enzon还有两种已经被FDA通过的PEG修饰蛋白商品：ADAGEN和ONCASPAR。
ADAGEN用于缺失ADA而引起的严重联合免疫缺陷病（SCID）；ONCASPAR即PEG修饰的天冬酰胺酶（L-asparaginase），用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL），天冬酰胺酶需要隔天注射，而PEG修饰后可以一周注射一次，还可以减少过敏。
另外，罗氏公司生产的抗病毒性肝炎特效药派罗欣，日前获得了瑞士国际药品管理署的销售许可。
瑞士权威机构的认证是基于两个国际多中心三期临床试验的结果，该试验表明，每周注射一次派罗欣可以获得长久的持续病毒学反应，疗效比标准干扰素高出许多。
特别是对伴有肝硬化的难治性患者也有显著的效果。
蛋白修饰分析报告
蛋白修饰分析报告1. 引言蛋白修饰是生物体内一种重要的生物化学过程，通过改变蛋白质的结构或功能来调节细胞内的信号传导、代谢活性和基因表达。
蛋白修饰可以发生在蛋白质的氨基酸残基上，常见的修饰类型包括磷酸化、甲基化、乙酰化等。
本文将介绍蛋白质修饰的分析方法和步骤。
2. 磷酸化分析磷酸化是蛋白质修饰中常见的一种类型，通过酶催化将磷酸基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
磷酸化的分析可以采用质谱法进行。
以下是磷酸化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
•液相色谱分离：将消化后的样品通过液相色谱进行分离，以分离出不同的肽段。
•质谱分析：将分离出的肽段通过质谱仪进行分析，其中包括质量/电荷比（m/z）的测定和碎片谱的记录。
•数据分析：对质谱数据进行分析，通过数据库查询和标准库匹配来鉴定磷酸化位点。
3. 甲基化分析甲基化是蛋白质修饰中另一种常见类型，通过酶催化将甲基基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
甲基化的分析同样可以采用质谱法进行。
以下是甲基化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
•液相色谱分离：将消化后的样品通过液相色谱进行分离，以分离出不同的肽段。
•质谱分析：将分离出的肽段通过质谱仪进行分析，包括质量/电荷比（m/z）的测定和碎片谱的记录。
•数据分析：对质谱数据进行分析，通过数据库查询和标准库匹配来鉴定甲基化位点。
4. 乙酰化分析乙酰化是蛋白质修饰中的另一种常见类型，通过酶催化将乙酰基团添加到蛋白质的氨基酸残基上。
乙酰化的分析同样可以采用质谱法进行。
以下是乙酰化分析的步骤：•样品制备：将待分析的蛋白质样品提取出来并纯化，以得到高纯度的样品。
•消化降解：使用特定的酶对蛋白质进行消化降解，以获得适合质谱分析的肽段。
浙江大学830生物化学2008年试题详解及命题点评
浙江大学830生物化学2008年试题详解及命题点评1 什么是膜蛋白？举例说明膜蛋白的主要特征和生物学功能（10）细胞中大约有20%-25%的蛋白质与膜结构联系在一起，称为生物膜，是生物膜功能的主要承担者。
根据蛋白分离的难易及在膜中分布的位置，膜蛋白基本可分为两大类：外在膜蛋白和内在膜蛋白。
外周膜蛋白分布于膜的脂双层的表面，通过静电力或非共价键与其他膜蛋白相互作用连接在膜上，如血影蛋白，是支撑红细胞外形的膜骨架的主要成分。
其特点是易于分离，通过改变离子强度或加入加入金属螯合剂即可提取，这类蛋白质都溶于水。
膜内在蛋白主要靠输水力与膜脂相结合，有的部分镶嵌在脂双层中，有的横跨全膜。
例如细菌视紫红质，它能将光能装化为化学能。
这类蛋白质不易分离，不溶于水。
膜蛋白与生物膜的多种生物功能紧密相关，如物质运输时，红细胞膜上的带3蛋白的阴离子运输功能，如信号传导过程中，接受信号分子的膜受体蛋白，如G蛋白，谷氨酸受体等。
【恩波翔高点评】重点，理解基本概念，并能联系不同知识点，熟悉各种膜蛋白的功能。
2 如何理解在酶催化作用的高效性和专一性理论中论述的“来自酶与底物相互作用的结合赋予了催化反应的高效性和特异性”，并举例说明。
（10）酶对催化的反应和反应物有严格的选择性，一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，以促进一定的化学变化，并生成一定的产物，这种现象称为酶的特异性或专一性有的底物特异性几乎严格地只限于一种类型底物〔（脲酶）EC．3．5．1．5等〕，也有的不太严格，能作用于多数同类化合物〔（磷酸化酶）EC 3．1．3．1和3．1．3．2等〕。
在后一情况下，因化合物不同反应速度也有所不同。
对光学异构体来说，也只能作用其中的一种，多数情况下，反应的类型可因酶而定。
当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合进行反应。
使底物分子接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生，具有高效性，且能特异的与结构上更易互补，能形成酶-底物复合物的一类底物特异的反应。
n端乙酰化肽段富集_概述及解释说明
n端乙酰化肽段富集概述及解释说明1. 引言1.1 概述N端乙酰化肽段富集是一种重要的蛋白质组学研究技术，它可以通过富集具有N 端乙酰化修饰的肽段来了解蛋白质的修饰状态和功能。
乙酰化是一种常见的蛋白质修饰方式，它能够调节蛋白质的功能、相互作用和代谢通路等生物学过程。
因此，对N端乙酰化肽段进行富集分析有助于揭示蛋白质乙酰化修饰在细胞活动中的重要作用。
1.2 文章结构本文首先介绍了乙酰化肽段的定义和特点，包括其在蛋白质结构上的位置以及与其他修饰方式的关系。
然后，文章详细描述了N端乙酰化肽段富集技术的发展历程，从最初的传统方法到现代高通量技术的进展。
接下来，我们将介绍N端乙酰化肽段富集的原理和方法，并讨论各种技术在实际应用中存在的优缺点。
最后，我们将分析该技术在蛋白质组学研究、疾病诊断和治疗中的应用前景，并探讨其存在的问题及改进方向。
文章最后给出总结并展望未来关于N端乙酰化肽段富集技术的研究方向。
1.3 目的本文的目的是系统综述N端乙酰化肽段富集技术的原理、方法和应用前景，以期提供对这一领域感兴趣的读者全面了解该技术的发展历程、优势和挑战，并引起更多科研人员对其进一步探索和改进的兴趣。
通过深入剖析N端乙酰化肽段富集技术在蛋白质组学研究和生命科学领域中的重要意义，我们希望为相关研究提供新思路和潜在应用方向，并促进该领域更深入、更广泛地开展工作。
2. 正文2.1 乙酰化肽段的定义和特点乙酰化是指在肽链或蛋白质的氨基末端（N端）加上乙酰基。
乙酰化肽段指的是具有N端乙酰化修饰的肽段，这种修饰在生物体内普遍存在且具有重要的功能。
乙酰化肽段主要通过与细胞内蛋白去乙酰化修饰酶相互作用来广泛调节蛋白质的功能和稳定性。
乙酰化肽段具有多种特点。
首先，它们在细胞中扮演着重要的调控角色，可以影响蛋白质的折叠、定位和交互等生物活动。
此外，乙酰化还可以作为信号传导的关键步骤，在细胞信号通路中发挥重要作用。
除此之外，一些研究表明，许多重要的疾病如癌症、神经退行性疾病等与蛋白质N端乙酰化水平异常相关。
蛋白质修饰及其对蛋白质稳定性的影响分析
蛋白质修饰及其对蛋白质稳定性的影响分析在细胞内，蛋白质是最基本的生物大分子之一。
一个蛋白质所需的氨基酸数量和序列的排列方式相当复杂，是由基因编码控制的。
但是，在把氨基酸链接在一起之后，蛋白质还经过多个层面上的修饰，包括脯氨酸、酰化、糖基化、磷酸化等。
这些修饰可以影响蛋白质的生物学功能、稳定性、折叠和解折叠等性质。
蛋白质修饰中很重要的一类是糖基化。
在这种修饰中，碳水化合物基团被加到蛋白质的羟基、胺基、硫醇基和磷酸酯基等位置上。
糖基化通常被认为是“衰老指标的指标”。
此外，糖基化还可以增加蛋白质的分子量、改变蛋白质的稳定性。
具体而言，糖基化修饰可以影响蛋白质在缩合状态下的稳定性。
它可能增加蛋白质与其他蛋白质或小分子的相互作用力，也可能增加蛋白质与朊病原体结合的力度。
此外，糖基化还能够改变蛋白质的折叠状态。
在一些情况下，糖基化可以使蛋白质折叠成稳定的、紧密接触的构像，从而增加蛋白质的稳定性。
在另一些情况下，它可能导致蛋白质局部的不稳定，因为新型糖基化修饰与其他已存在的修饰相互干扰。
除了糖基化，磷酸化是另外一种常见的蛋白质修饰，可增加蛋白质的稳定性。
这种修饰与蛋白质的结构、机能、调节、信号转导和交互有关，并被广泛应用于生物学的研究和治疗上。
磷酸化对蛋白质稳定性的影响是多方面的。
在一些情况下，磷酸化可以增加蛋白质与其他分子的结合力，从而增加其稳定性。
磷酸化还可以强化蛋白质的折叠与结构，提高其稳定性。
此外，磷酸化还可以影响蛋白质的降解或寿命。
最近的研究表明，多肽修饰的可控变化可以用在改变蛋白质的稳定性和体内半衰期上，比如将未修饰的蛋白质转化为折叠稳定的形态，并固定到蛋白质上。
这种方法的关键是创造一种多肽分子，具有高度的可控性和特异性，可以选择性地反应到目标蛋白质上，从而固定、稳定折叠状态。
因此，对蛋白质的修饰是细胞中非常重要的过程。
这种修饰会影响蛋白质的稳定性、构象、亚细胞定位、酶活性、信号传递等生物学性质。
质谱法测定肽段氨基酸序列
质谱法测定肽段氨基酸序列
质谱法可用来测定肽段的氨基酸序列。
在这个过程中，肽段首先会被分离和纯化，然后通过质谱仪进行分析。
一般来说，有两种比较常用的质谱技术来测定肽段的氨基酸序列：
1.MALDI-TOF（基质辅助激光解吸飞行时间质谱）：这种技术可用于分析中小分子质量，包括肽段。
样品通过激光辐射后，氨基酸的离子化产物会在质谱仪中被探测和测定。
2.质子化电喷雾离子化质谱（ESI-MS）：这项技术在生物医学和生物化学研究中得到广泛应用。
它可以将氨基酸和肽段通过电喷雾离子化，并通过质谱仪得到其质荷比（m/z）值。
蛋白质合成后修饰
第三节蛋白质合成后的修饰述：合成后的多肽需经一定的加工，修饰或互相聚合才有活性。
蛋白质合成后的修饰包括对多肽链一级结构和空间结构和空间结构的加工修饰等。
一、多肽链一级结构的修饰（一）肽链N端的修饰述：去除N端Met（氨基肽酶）fMet（脱甲酰基酶、氨基肽酶）或在N端的附加序列。
该修饰不一定在肽链合成后进行，也可以发生在肽链合成过程中。
（二）个别氨基酸残基的修饰述：某些蛋白质的正常生物功能需要肽链中部分氨基酸残基进行共价修饰。
例：羟化；磷酸化；形成二硫键等（三）部分肽段的切除述：某些无活性的蛋白前体通过酶的水解，内切或外切一个或几个氨基酸残基，使蛋白质具有生物活性。
例：无活性的酶原转变为有活性的酶，常需要去掉一部分肽段。
胰岛素原水解生成胰岛素、分泌性蛋白质N端信号肽的切除二、天然空间结构的形成述：许多功能复杂的蛋白质,由两条以上肽链及其它辅助成分通过非共价键聚合形成多聚体才有活性。
（一）多肽链折叠为天然构象蛋白质述：一级结构是空间构象的基础，多肽链合成后除了要进行一级结构的修饰外，还需要逐步折叠成天然空间构象才成为有生物活性的蛋白质。
大多数天然蛋白质折叠需要其他酶和其他蛋白质辅助，使新生肽链形成正确的二级结构、模体、结构域，直至完整空间构象。
（二）空间结构的修饰述：多肽链合成后，要成为有完整天然构象和全部生物活性的蛋白质，除了进行天然空间结构折叠外，还需要经过一定的空间结构修饰。
1．辅基连接述：合成蛋白由蛋白质和辅基（或辅酶）两部分组成，合成后都需要结合相应的辅基，成为天然功能的蛋白质。
2．亚基聚合述：由两个或两个以上相同或不同的亚基通过非共价连接聚合成具有四级结构的蛋白质寡聚体。
例：血红蛋白分子由α、β亚基形成四聚体蛋白α2β2 。
3．疏水脂链的共价连接述：某些蛋白质合成后需要在肽链特定位点共价连接一个或多个疏水性强的脂链，才能成为具有生物功能的蛋白质。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第37卷分析化学( FENX I HUAXUE) 研究报告第7期2009年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry950～954研究报告规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象卢庄1, 2 赵丽艳2 张养军2 蔡耘21(北京理工大学生命科学与技术学院,北京100081)2 (蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206) _C)残基起始的肽段会发生氨基端的环化修饰,且修饰反应不完全,在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在,并且环化修饰后的肽段摘要对蛋白质样品制备中引入的氨基酸残基的一种现象初步研究结果显示,很多以谷氨酰胺(Q)或氨乙酰化修饰的半胱氨酸(CAM邓玉林1 张玉奎1 钱小红3 1, 2————蛋白质酶切肽段氨基端的环化修饰现象的的反相色谱保留时间发生延迟。
在数据库检索时添加环化修饰,可以提高蛋白质的鉴定成功率。
本研究结果为大规模的蛋白质质谱数据解析提供了有价值的参考。
关键词肽段氨基端,环化,规模化,蛋白质鉴定1 引言细胞或组织内存在的全部蛋白质的定性和定量分析是蛋白质组学研究的主要内容[1]。
为了从细胞中鉴定目标蛋白质,候选蛋白质常用串联质谱(MS/MS)法[2, 3]结合生物信息学的数据库检索进行分析。
样品中的蛋白质通常先被胰蛋白酶消化成较小的肽段,然后经反相色谱分离进入质谱;肽段经离子化、碎裂后,产生用于鉴定的特征的MS/MS数据;通过在理论序列数据库中搜索MS/MS谱图来寻找最佳匹配的肽段,从而鉴定样本蛋白质。
然而,在实际的蛋白质鉴定中,通常只有或少于10%的MS/MS谱图能够有效地鉴定出蛋白质,而大量的图谱都不能被解析[4]。
MS/MS数据没有得到可靠的鉴定结果,除了谱图质量差,还有一个原因就是匹配不好。
很多碎片信息很丰富的MS/MS谱图在检索时的得分也很低,其原因是可能此肽段在数据库中不存在、或某些蛋白质本身存在,但人工处理过程中引入的各种氨基酸残基的多种修饰影响其鉴定。
蛋白质修饰的多样性和不均一性造成检索时实验值与理论值不相匹配,进而影响其质谱数据的正确解析。
目前,肽段鉴定时常用的添加残基修饰有甲硫氨酸(Met)的氧化和半胱氨酸(Cys)的氨乙酰化,而对其它修饰研究很少。
文献报道,以谷氨酰胺(Q)、谷氨酸( E)或氨乙酰化修饰的半胱氨酸(CAM _C)残基起始的肽段,在样品处理[10 ]或者自发[ 11 ]等状况下都会发生氨基端的环化修饰。
这些发生了环化修饰的肽段由于质量数的偏移,在数据库检索时经常不能被正确鉴定。
为了给蛋白质的鉴定分析提供更准确、完整的信息,得到更可靠的鉴定结果,本实验对蛋白质酶切肽段的端肽环化修饰现象进行了初步研究。
2 实验部分2. 1 仪器与试剂毛细管高效液相色谱2电喷雾2线性离子阱质谱仪(CapLC2ESI2LTQ 2MS, Thermo Finnigan公司);安捷伦1100毛细管色谱系统,包括自动上样器,上样泵(含十通阀)和二元洗脱泵(Agillent公司) ; 4800 Pro2teom ics Analyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(MALD I2TOF2TOF MS,美国AB I公司);电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂) ;BP211d分析天平(瑞士Sartorius公司)。
2008208229收稿; 2008212218接受本文系国家自然科学基金(Nos. 20635010, 20505018, 20735005)和国家重点基础研究计划(No. 2007CB914104)资助项目E2mail: qianxh@nic. bmi. ac. cn. 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第7期卢庄等:规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象所有标准蛋白均购自Sigma公司;碘乙酰氨( IAA )和甲酸( FA )购自比利时ACROS公司;乙腈(HPLC级,美国J. T. Baker公司);胰蛋白酶( Tryp sin,测序级)和二硫苏糖醇(DTT)购自美国Promega公司; 0. 45μm滤膜有机相微孔过滤膜(天津津腾公司);超纯水由M illipore2Q A10型纯水系统(美国M il2lipore公司)制备,其它试剂均为国产分析纯。
2. 2 实验方法2. 2. 1 蛋白质样品的处理按照目前蛋白质组研究中经典的蛋白质变性、还原、烷基化的处理步骤处IAA溶液在室温下置于暗处反应1h。
然后稀释样品至其中尿素浓度<1 mol/L后,按照胰蛋白酶与蛋白质质量比1∶表1 不同比例的10种标准蛋白质混合物的配制名称Protein name理蛋白质样品[5] ,操作如下:牛血清白蛋白(BSA )及按照不同比例混合的10种蛋白质混合物(如表1) ,分别溶于含8 mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3缓冲液(pH 8. 0)中,各加入终浓度10 mmol/L的DTT溶液,在37℃水浴中反应4 h,再加入终浓度25 mmol/L的Table 1 Proteinmixture containingdifferentamountsof10 different standardproteins 终浓度50加入胰蛋白酶, 37℃孵育12～18 h,微波加热中止酶切反应。
物种SwissProt.号Concentration Taxonomy SwissProt number(μmol/L)α2乳清蛋白α2Lactalbum inβ2酪蛋白β2Casein牛奶M ilk牛奶M ilkP00711P026667. 04. 2肌红蛋白Myoglobin马心肌Horse skeletal muscle P68082 5. 9细胞色素C Cytochrome C牛心Bovine heart P62894 8. 6溶菌酶Lysozyme鸡蛋清Chicken egg white P00698 7. 0β2乳球蛋白β2Lactoglobulin牛奶M ilk P02754 5. 5卵清白蛋白Ovalbum in鸡蛋Chicken egg P01012 2. 3核糖核酸酶A R ibonuclease A牛胰脏Bovine pancrease P61823 6. 1人白蛋白Human album in人Human P02768 1. 5胎球蛋白Fetuin牛Bovine P12763 2. 82. 2. 2 RPLC2L TQ反相色谱条件毛细管液相色谱仪所用毛细管色谱柱为PicoFritTM BioBasic2C18反相柱(100 mm ×75μmi.d. ,5μm, Thermo Hypersil公司)。
色谱洗脱采用二元泵高压混合的梯度洗脱方式。
洗脱组分经过ESI离子源直接进入质谱进行分析。
流动相:A为0. 1% FA 280%水溶液),B为0. 1% FA 280% ACN溶液。
洗脱条件: 2%～40% B, 90 min; 40%～100% B, 15 min,然后以100%A溶液平衡色谱柱30 min。
流速为200 nL /m in;进样体积为20μL。
2. 2. 3 RPLC2L TQ质谱分析条件质谱仪为电喷雾2线性离子阱质谱仪(LTQ MS)。
雾化N2气流速12 L/min;碰撞气为高纯氩气(99. 999% ) ;喷雾电压(spray voltage) 3. 2 kV;毛细管温度160 ℃;毛细管电压2. 8 kV。
数据依赖采集条件:质谱分析采用一级质谱的数据依赖的二级质谱扫描模式。
利用动态排除功能,设置排除时间为0. 5min。
二级串联质谱母离子窗口为4 Da,归一化碰撞能量为35% ;质谱的一级全扫描质荷比范围是m /z 400～4000。
本实验所用[M +H] +均为单同位素峰质量数。
2. 2. 4 数据检索参数设置质谱采集的原始文件首先通过BioWorks3. 2软件转换为dta文件,然后使用软件程序merge. pl将dta文件合并成mgf文件,使用Mascot(版本2. 1)检索。
设定肽段序列氨基酸可变修饰为甲硫氨酸氧化(M +15. 99 Da) ,设置半胱氨酸的氨乙酰化修饰(C +57. 02 Da)为固定修饰;第二次检索时增加肽段氨基末端残基可变修饰:氨基末端Q /E/CAM _C的环化(Q 217. 03Da,E218. 01 Da,CAM _C217. 03 Da)修饰。
设定蛋白酶为胰蛋白酶,酶切方式为全酶切,最大漏切位点2个,一级母离子误差1. 5Da,二级碎片离子误差0. 8Da。
检索蛋白质数据库为自建标准蛋白质数据库。
检索肽段可靠度设置为95%。
3 结果与讨论3. 1 BSA胰蛋白酶酶切肽段混合物中的肽段环化修饰现象不考虑漏切位点时, BSA胰酶酶切肽段中>500 Da、并以Q /E/CAM _C残基起始的肽段分别有3、5. 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 分析化学第37卷和4个。
质谱分析的结果显示,这12个肽段中的8个都发生了肽段氨基端环化修饰,鉴定结果如表2。
其中,原型检索设置的修饰为固定修饰:半胱氨酸的氨乙酰化;草药可变修饰:甲硫氨酸氧化。
环化检索设置的修饰为固定修饰:半胱氨酸的氨乙酰化;可变修饰:甲硫氨酸氧化和氨基末端Q /E/CAM _C的环化。
表2 BSA中发生环化修饰的肽段Table 2 Terminal cyclized peptides from BSA序号肽段序列肽段理论质量数保留时间肽段最高分检到次数No.SequenceTheoretic massRPLCRetention timeScoreTimes of detection15.15 14 351 K. QTALVELLK. H原型原型Initial form : 1067. 4342 14. 19环化Cyclization form: 1050. 4077 15. 83原型Initial form: 1672. 7627 16. 45环化Cyclization form: 1655. 7362 17. 92原型Initial form: 705. 3479 13. 92Initial form: 1013. 6121 23. 3842193935 7环化Cyclization form: 996. 5855 25. 7716.84 56 9环化Cyclization form: 1120. 4641 18. 37 31 36环化Cyclization form: 688. 3214K. CCTESLVNR. R原型Initial form: 1137. 4907 R. CCTKPESER. M原型Initial form: 1165. 4856 12. 80 27 1环化Cyclization form: 1148. 4590 14. 77 49 642 K. QNCDQFEK. L443 K. QEPERNECFLSHK. D25 445 14 R. CASIQK. F427K. CCAADDKEACFAVEGPK. L原型Initial form: 1926. 7910 18. 23 77 3环化Cyclization form: 1909. 7644 19. 77 90 4K. CCAADDKEACFAVEGPKLV2 原型Initial form: ---8VSTQTALA. 2环化Cyclization form: 2893. 3296 18. 58 13 19 K. ECCDKPLLEK. S原型Initial form: 1290. 5948 15. 90 33 4环化Cyclization form: 1272. 5842 17. 57 25 1添加环化修饰为可变修饰,对数据进行数据库检索,比添加修饰前多解析了27个二级质谱图,共找到10条肽段发生了环化修饰。