荧光探针在细胞生物学中的运用

DAPI荧光染料
（1）与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍 ；与单链DNA结合无荧光的增强； （2）荧光强度比Hoechst低，但光稳定性强 于Hoechst （3）DAPI选择性地与DNA相结合，其特异性 比EB和PI高 二氢乙锭荧光染料 与DNA结合后产生蓝色荧光。若进入的活细胞 能使二氢乙锭脱氢氧化为乙锭，则乙锭插入DNA 链中发出红色荧光
相结合，荧光增强。
核酸荧光探针
它们能以非共价键的方式与DNA/
RNA相结合
根据能否穿透膜渗入活细胞内，
分为：胞膜透过性和非透过性核
酸探针
透性核酸荧光探针
SYTO核酸染料
（1）核酸透性染料，对活细胞和死细胞的RNA和 DNA均可进行染色 （2）可分为蓝色、绿色、橙色和红色等颜色染 料 （3）SYTO绿色染料是一种细胞透性的对RNA进行 专一性染色的染料
发出绿色荧光，根据内质网的形态学特征很容易识
别
培养细胞染色时，将适量DiOC6(3)加到培养液中。
DiOC5(3)
也属于短链碳酸花氰苷染料，其染色特点及用途与
DiOC6(3)相似
DiIC16(3)、DiIC18(3)
激发波长为550nm，发射波长为564nm，均
呈黄色荧光
高尔基体荧光探针
活体荧光材料---绿色荧光蛋 白（GFP）
GFP须在UV激发下才发出绿色荧光 GFP分子量小（20kD），其融合蛋白不影
响结合蛋白的生物学功能，转染的细胞可 继续传代
Stratagene升级版Vitality hrGFP II绿
色荧光蛋白更明亮，毒性更低，成为哺乳
动物细胞相关研究的最佳选择
非细胞透性核酸荧光探针
溴化乙锭（EB）和碘化丙锭（PI）：不能透过活
细胞进入细胞内，它们与核酸的结合特异性低。 PO-PRO、BO-PRO、YO-PRO和TO-PRO荧光探针： （1）新的非细胞透性核酸荧光探针 （2）未与核酸结合时，荧光强度接近于零 （3）与双链DNA亲和力很高 （4）在溶液中与DNA结合很牢固，可定量检测溶液 中的DNA （5）不进入活细胞，用于活细胞的膜完整性研究
用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光 泽灭。 如紫外线照射、高温( >20℃ )、
苯胺、酚、硝基苯、 I-等 。
与荧光发射形式竞争能量，会导致原来能 够发荧光的物质分子不能发出荧光的现象。
荧光探针实验时的注意事项
合适的pH值、溶剂和温度 染色容易最好新鲜配制
配高浓度的储存液，临用前稀释
内活性氧自由基的量直接相关。
激光扫描共聚焦显微镜技术
基本功能
（一）多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 光学显微镜分辨率: 0.25μm 共焦显微镜分辨率: 0.18μm
（二） 具有连续光学切片功能和Z向观察能力 样品厚度可达500μ m, 深度分辨率为0.1μ m；
扫描模式：xy：观察样品不同层面的荧光强度变化 xz：观察样品沿Z轴的荧光强度变化
激发态
释放能量
基态
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：
1）有强的紫外-可见吸收 2）有一定的荧光效率
荧光效率
定义: 荧光物质分子将光能转变成荧光的
百分率 计算公式:
发射荧光的光量子数（荧光强度）
荧光效率=
吸收光的光量子数（激发光强度）
荧光效率越高，荧光强度越强。
荧光的淬灭及抗淬灭
淬灭定义: 荧光物质在某些理化因素作
G-肌动蛋白荧光探针
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）能与G-肌动
蛋白结合。当DNase I标记上荧光素、四甲 基罗丹明或Texas红等荧光基团即成为荧光 探针
荧光素DNase I与BONIPY鬼笔环肽结合应用
，可同时观察F-肌动蛋白和G-肌动蛋白
微管蛋白荧光探针
荧光素秋水仙碱探针：秋水仙碱可特异性地与微管
钙调节及活性的荧光探针
钙调蛋白荧光探针
钙的类似物如三氯化铽或其它三价镧
系化合物可被激发荧光，它们能与钙
调蛋白I和II位点相结合
加入Nd3+可使这类探针的荧光淬灭
研究钙调蛋白时，可配合应用钙调蛋
白拮抗剂如W-5、W-7等
蛋白激酶C（PKC）荧光探针
佛波乙酸酯荧光探针：佛波乙酸酯能与PKC特异
NBD Ceramide：呈绿色荧光，激发波长为
464nm，发射波长为532nm，适用于活细胞 和固定细胞染色
BODIPY Ceramide：呈红色荧光，激发波
长为505nm，发射波长为511nm。既可用荧
光显微镜观察，也可用电子显微镜观察。
细胞骨架荧光探针
细胞骨架主要包括微管、微丝
和中间丝，而微丝主要由细肌 丝（肌动蛋白为主）和粗肌丝 （肌球蛋白为主）组成 着重介绍肌动蛋白及微管蛋白 的荧光探针
即用型：储存于甘油中
浓缩型：用于不适合用甘油作为封片剂的实验中
常见的荧光染料（探针）
细胞器荧光探针
线粒体荧光探针
线粒体荧光探针主要有：JC-1、Rhodamine
123、Rhodamine 6G、DiOC7(ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ)、DASPMI和 DASPEI等
JC-1
JC-1在浓度或线粒体膜电位低时，以单体存在，
避免储存时间过长
荧光淬灭的作用因素
光照射 荧光物质的分子与外部分子形成非荧光
的络合物
共振能量的转移
溶剂种类、pH值
温度
抗淬灭剂
常用的抗荧光淬灭剂 （1）p-笨二胺（PPD）：最有效抗淬灭剂之一，但 对光和热都有较强的敏感性；有毒性，不宜体内研 究。
（2）n-丙基没食子酸盐（NPG）：无毒性，对光和 热稳定，但抗荧光漂白的效果不如PPD。
（四）TUNEL法
ROS检测
2’7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）对氧化剂
不敏感，但其具有亲脂性，能够自由扩散进入细胞 内，进入细胞后被酯酶水解为亲水性不发荧光的 2’7’- 二氯氢化荧光素（ DCFH ），从而保留在胞 质中。DCFH易被细胞质中的活性氧自由基（主要是 过氧化氢）氧化为具有荧光的DCF，DCF的量与细胞
内质网荧光探针
内质网的荧光探针主要有
：DiOC6(3)、DiOC5(3)、 DiIC16(3)、DiIC18(3)
DiOC6(3)
激发波长为459nm，发射波长为584nm 不仅用于标记活细胞内质网，也用于甲醛固定的细
胞中的内质网
DiOC6(3)进入细胞内与内质网结合，在激光激发下
A Series of Image of xy-section
Cultured gliocyte of rat brain stained by Fluorescin.
（三）活组织和活细胞的动态变化
F-肌动蛋白荧光探针
鬼笔环肽及其衍生物鬼笔毒素的荧光标记物是
理想的F-肌动蛋白探针，其特点： （1）一个鬼笔毒素可结合一个F-肌动蛋白亚基 ，但不与G-肌动蛋白单体结合 （2）使F-肌动蛋白更稳定：可抑制细胞松弛素 、碘化钾或高温的解聚作用 （3）不影响肌动蛋白与其他蛋白结合 （4）不影响肌动蛋白的功能 （5）可溶于水，易被可见光激发
与亲脂性Rhodamine及碳酸花氰苷染料不
同，Rhodamine不能染色内质网
当细胞反复冲洗时， Rhodamine 123通常
不被细胞保留
溶酶体荧光探针
DAMP：是一种弱碱性胺，溶酶体呈
蓝色荧光，激发波长是346nm
中性红：溶酶体呈红色荧光，激发
波长为541nm，发射波长为640nm
荧光技术 在细胞凋亡研究中的运用
（一）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微 镜观察
常用的DNA特异性染料有: HO33342(Hoechst
33342)、HO33258(Hoechst33258)、DAPI。紫外 光激发时发射明亮的蓝色荧光 Hoechst是与 DNA 特异结合的活性染料，储荐 液用蒸馆水配成 1mg/ml 的浓度，使用时用PBS 稀释成终浓度为 0.2-0.5mg/ml DAPI用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馆 水配成成 1mg/ml 的浓度，使用终浓度一般 0.5mg/ml
（3）1,4-二偶氮双环【2,2,2】-辛烷（DABCO）： 非离子性、稳定性的抗淬灭剂，价格便宜且容易使 用，可用于体内研究。
抗荧光淬灭试剂盒
（分子探针公司）
ProLong抗淬灭试剂盒 SlowFade和SlowFade Light抗淬灭试剂盒
（1） SlowFade：可使黄色荧光淬灭
（2） SlowFade Light：改善SlowFade不足
而合成的，它们与钙结合的部位均位 于羧基，结合后即有荧光变化。至今 已有三代钙荧光探针。 第一代：quin-2 第二代：Indo-1和Fura-2 这两代钙的探针均需要紫外线激发
第三代：Fura-3
Fura-3的酯化形式即乙酰羟甲基酯（AM
），不发荧光，但能透过细胞膜，在胞内
的非特异性酯酶作用下水解AM，与游离钙
激发波长为490nm，发射波长为527nm，呈绿色荧 光；当浓度升高或线粒体膜电位升高时，JC-1形 成J-聚体，呈红色荧光，激发波长为490nm，发 射波长为590nm；
JC-1是检测活细胞线粒体膜电位最合适的探针。
Rhodamine 123
是一种能渗入细胞，带阳离子的荧光探针 线粒体被Rhodamine 123染成绿色
吖啶橙（AO）：阳离子荧光探针，与DNA
结合时，最大发射波长为525nm；与RNA结 合时，最大发射波长为650nm Hoechst荧光探针： （1）特异性强，专一性地与DNA结合 （2）细胞毒性小 （3）5-溴脱氧尿核苷（BrdU）与DNA结合 ，可使Hoechst探针的荧光淬灭，因而可用 于检测BrdU处理过的活细胞的增殖状态
性结合，BPDIPY、Dansyl和NBD标记的佛波乙酸 酯即为荧光探针。 Dansyl佛波酯的荧光随其与
PKC的结合而增强； BPDIPY佛波酯的荧光不易受
环境影响
乙酰辅酶A荧光探针：乙酰辅酶A能调节PKC的二
酰基甘油活性，标记上荧光后可间接监测蛋白激
酶C的活性
钙离子荧光探针
钙荧光探针均以钙螯合剂EGTA为基础
蛋白结合，抑制微管蛋白组装，但标记上荧光素可 用于微管蛋白的研究 DAPI探针： DAPI属于核酸染料，但在体外可与纯 化的微管蛋白结合，而不影响微管蛋白的装配或 GTP的水解，这种探针可用于微管蛋白装配动力学 研究 DCVJ探针：与微管二聚体的特异位点结合，是追踪 活细胞内微管蛋白聚合的有效探针。 DCVJ在活细 胞内的染色可被细胞松弛素D阻断，可用于活细胞 内微管蛋白的多聚化研究
荧光探针在细胞生物学中的运用
王世鄂 福建医科大学基础医学院
荧光及发光原理

光致发光：物质受到光照射时，除吸收 某种波长的光之外还会发射出比原来所 吸收的波长更长的光，这种现象称为光 致发光。

荧光：物质分子接受光子能量被激发后， 从激发态的最低振动能级返回基态时发
射出的光。

荧光的产生
基态
光辐射
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期: 1期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓 缩状态；IIa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； IIb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体
（二）磷脂酰丝氨酸外翻分析 （Annexin-V）
磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细
胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的 表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结 合。将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了 的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显 微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙锭（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的 细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透 过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配 使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开 来。
（三）线粒体膜电位的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种
细胞凋亡剌激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡 ，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡 级联反应过程中最早发生的事件。
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧
光染料等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或 减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。