ERGIC3的稳定表达细胞株的建立与鉴定

ERGIC3的稳定表达细胞株的建立与鉴定郑翔，刘兴宇，李学英，吴明松*（遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义563000）[摘要] 目的构建ERGIC3基因的真核表达载体，通过将载体转染支气管上皮细胞株BEAS-2B，筛选并建立ERGIC3稳定表达的细胞株，为进一步研究ERGIC3在肺癌中的作用奠定基础。

方法采用RT-PCR方法获取人类ERGIC3基因的ORF 框的DNA序列；构建逆转录病毒载体pLXSN-ERGIC3，用PT-67细胞包装后获得病毒颗粒；用病毒颗粒感染BEAS-2B细胞；通过G418筛选获取整合了外源基因ERGIC3的细胞；单克隆化成为稳定转染ERGIC3细胞株；然后用定量RT-PCR和Western blot进行鉴定后，用划痕实验研究稳定转染细胞株的迁移能力和形态学变化。

结果获得了4个ERGIC3稳定表达细胞株，这些细胞株的ERGIC3表达量远高于对照组细胞。

稳定转染细胞株的迁移能力显著增强（P<0.05）。

结论成功的构建了ERGIC3基因的真核表达载体pLXSN-ERGIC3；筛选出ERGIC3基因稳定转染支气管上皮细胞株且其迁移能力明显增加。

[关键词] ERGIC3；稳定转染；真核表达；肺癌[中图分类号] Q782[文献标志码] A Construction and identification of cell lines with ERGIC3 gene stable transfectionZHENG Xiang, LIU Xing-yu, LI Xue-ying, WU Ming-song(Department of Cell Biology and Genetics, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563000, China)[Abstract]Objective To construct a eukaryotic expression vector carrying human gene ERGIC3 and to obtain human bronchial epithelial cell line stably transfected with ERGIC3, which provides the foundation of ERGIC3 in lung cancer. Methods The pLXSN retroviral vector was inserted the DNA fragment of open reading frame sequence (ORF) of gene ERGIC3 which obtained by PCR method. After the constructed pLXSN vector was transfected into the packaging cell, PT67 cell line for 48 hours, the replication-incompetent retroviral particles were harvested and infected the BEAS-2B cells. Screened with G418，the single cell clones were sought out and cultured which were stable transfection cell lines. Then the migration of the cell lines was tested by wound healing scratch assay. Results The vector carrying ERGIC3 was successfully constructed and 4 stable transfection cell lines were obtained, as well as the ERGIC3 expressions were higher than the control by real-time PCR and Western blot. The ability of the stable transfected cell line with ERGIC3 was significantly faster than the control cell (P<0.05). Conclusion The stable cell lines with expression [基金项目] 贵州省科学技术基金（黔科合J字[2013]2319号）；遵义医学院博士启动基金（F-655）。

[通讯作者] 吴明松，男，博士，研究方向：肿瘤细胞分子生物学，E-mail：hanyue4187@。

ERGIC3 have been successfully constructed and the migration ability of the cells increased significantly.[Key words] ERGIC3；Stable transfection；Eukaryotic expression；Lung cancer ERGIC3主要参与蛋白质从内质网到高尔基体的早期运输，近年的研究显示，ERGIC3在肺癌、肝癌中异常高表达，还参与肺癌[1]、肝癌[2]的发生发展，以及抑制BFA诱导的HEK-293细胞凋亡[3]。

然而机制尚不清楚。

大多数肺癌起源于支气管上皮细胞[4]，因此我们构建了pLXSN-ERGIC3真核表达载体，并将其转染入支气管上皮细胞，筛选出稳定转染ERGIC3的支气管上皮细胞株，为进一步研究ERGIC3基因在肺癌中的作用奠定实验基础。

1材料与方法1.1 试验材料BEAS-2B细胞、PT-67细胞由中科院昆明动物所曹毅研究员惠赠。

pLXSN 载体购自美国Clontech公司，DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，SYB Green购自Invitrogen公司，逆转录酶购自Promega 公司，Taq酶购自Sigma公司，定量PCR仪购自Bio-rad公司。

1.2 细胞培养BEAS-2B细胞和PT-67细胞生长于含10% 胎牛血清DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

2～3天换液，3～5天传代，细胞处于对数生长期时用于实验。

1.3 引物设计及合成参照GenBank的人ERGIC3基因序列（NM_198398.1），用Primer 5.0 软件设计PCR引物，P1：5'-GGTGGTGAATTCATGAGGCGCTGGGGAAGCT-3'，P2：5'-GGTGGTGGATCCACCGAGGAGGGTGACTACGTTGTCTT-3'，在引物的5'端分别加上保护碱基GGTGGT和EcoR I、BamH I的酶切序列。

定量PCR引物：ERGIC3: F: 5'-GGAGAGGTACTGAGGACAAATCA-3'，R: 5'-AGCTCATAGAGGACGAAGACTC-3'; Actin: F: 5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，R: 5'-CAGGA AGGAAGGCTGGAAG-3'。

引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人ERGIC3基因的扩增用TRIzol试剂提取肺组织总RNA，以其为模板，随机引物为引物，用逆转录酶M-MLV合成cDNA。

再以此cDNA为模板，P1、P2 为引物，经PCR 扩增得到ERGIC3基因的ORF框DNA片段。

反应体系：cDNA模板5μl，10×缓冲液10μl，dNTP（10 mM）2μl，引物P1、P2（10 µM）各2μl，高保真Taq 酶2μl，灭菌水补足体积至100μl。

PCR反应程序：94℃5分钟，然后94℃30秒，58℃1分钟，72℃2.5分钟，30个循环周期。

定量PCR以β-Actin 为内参，采用2-∆∆CT方法[5]，以三次实验的平均△CT值计算基因的相对表达量。

1.5 重组真核表达质粒的构建PCR 产物和pLXSN质粒分别经EcoR I和BamH I双酶切，37℃酶切2小时后，琼脂糖电泳回收目的基因片段和载体片段，稀释浓度至50 ng/µl。

再用T4 DNA 连接酶连接，电转化感受态大肠杆菌DH5α，于含氨苄青霉素的LB培养基平板中37℃培养过夜，挑取阳性克隆，抽提质粒后进行PCR及双酶切鉴定，将初步鉴定正确的菌液送华大生物有限公司测序。

构建正确的重组表达质粒命名为pLXSN-ERGIC3。

1.6 pLXSN-ERGIC3逆转录病毒的包装PT-67细胞接种于25ml培养瓶中，第二天细胞汇合度在60%～80%，用脂质体Lipofectamine LTX转染pLXSN-ERGIC3质粒，48小时后收集病毒上清。

室温低速离心5分钟，去除细胞碎片，收集病毒液，用0.45 μm的醋酸纤维膜过滤病毒液，-80℃保存。

1.7 稳定转染细胞系的建立1.7.1 pLXSN-ERGIC3 病毒颗粒感染细胞BEAS-2B细胞接种于六孔板中，次日细胞汇合度在40%～60%，换为含有pLXSN-ERGIC3病毒颗粒的培养液，加入Polybrene，终浓度为6 μg/ml，24小时后换为正常培养液。

1.7.2 稳定转染细胞株的筛选与建立病毒颗粒感染后48小时，将细胞1:5 传代，同时培养液中加入G418 (终浓度为400 μg/ml)，每3-5天换一次含G418 的培养液，待长出克隆后将其挑出，进行单克隆化培养。

将上述的克隆挑取几个，用有限稀释法稀释细胞悬液，并接种于96孔板中。

于第二天和第三天观察，标记只有一个细胞的孔。

每3-5天换一次含G418 的培细胞迁移率＝ ×100％养液，待长出克隆后将其消化逐级扩大培养：96孔板、48孔板、24孔板、6孔板。

之后进行q-RT-PCR 和Western blot 鉴定。

1.8 稳定转染细胞株的鉴定1.8.1 q-RT-PCR 检测收集稳定转染细胞，提取总RNA 、逆转录以及PCR 等操作同上。

1.8.2 Western blot 检测收集稳定转染细胞，用适量细胞裂解液裂解并提取蛋白，BCA 法定量蛋白浓度，煮沸变性后，经SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭，4 ℃冰箱孵育一抗(ERGIC3 1：500，actin 1：10000)过夜，TBST 洗涤，然后室温孵育HPR 标记的二抗(1：2000) 1小时，用ECL 化学发光法进行曝光、显影。