利用响应面法优化出芽短梗霉As3.933产普鲁兰多糖发酵培养基

利用响应面法优化出芽短梗霉As3.933产普鲁兰多糖发酵培

养基

常帆;薛文娇;安超;马赛箭

【摘要】采用响应面分析法对出芽短梗霉As3.933产普鲁兰多糖的发酵培养基进行优化.首先利用Plackett-Burman实验筛选出影响普鲁兰多糖产量的主要因素为酵母膏、(NH4)2SO4和K2 HPO4,再利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,最后通过Box-Behnken实验并运用Design-Expert 8.0软件优化发酵培养基.确定优化培养基组成为:蔗糖62.5g· L-1,(NH4)2SO40.67 g· L-1,酵母膏2.84 g·L-1,K2 HPO4 7.12 g·L-1,NaCl 1.25 g·L-1,MgSO4· 7H2O 0.25g·L-1,pH值6.5,优化后的普鲁兰多糖产量达到22.29 g·L-1,较初始液体发酵培养基(17.32 g·L-1)提高了28.70％.

【期刊名称】《化学与生物工程》

【年(卷),期】2013(030)005

【总页数】4页(P42-45)

【关键词】普鲁兰多糖;培养基优化;Plackett-Burman设计;响应面法(RSM)

【作者】常帆;薛文娇;安超;马赛箭

【作者单位】陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安710043

【正文语种】中文

【中图分类】TQ929.2

普鲁兰多糖（Pullulan），又称茁霉多糖、短梗霉多糖等，是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵产生的一类多聚糖［1］，为右旋葡聚糖［2］。普鲁兰多糖是由麦芽三糖通过α－1，6－糖苷键连接形成的高分子量的线形多糖［3］，其中α－1，4－糖苷键与α－1，6－糖苷键的比例为2∶1，聚合

度为200～5000，平均分子质量为4．8×104～2．2×106 Da［4］。普鲁兰多

糖因其易溶于水、不凝胶化、可以任意加工成型、无毒性等特点应用于食品、医药、化工等诸多行业［5，6］，尤其是作为食品添加剂应用广泛［7］。

利用出芽短梗霉发酵产普鲁兰多糖时，碳源、氮源、营养因子、溶解氧水平、温度和pH值等因素都影响其形态特征和产物的形成［8］。作者借助统计学软件Design－Expert 8．0，采用响应面设计法（RSM）对影响普鲁兰多糖产量的主

要培养基参数进行优化，以期为生产中提高普鲁兰产量提供依据。

1 实验

1．1 菌种与培养基

出芽短梗霉As3．933，中国科学院普通微生物保藏中心。

PDA固体培养基（g·L－1）：马铃薯200．0，葡萄糖20．0，琼脂20．0。

液体种子培养基（g·L－1）：葡萄糖50．0，酵母膏2．5，NaCl 1．0，

MgSO4·7H2O 0．2，K2HPO45．0，（NH4）2SO40．6，pH 值6．5。

液体发酵培养基（g·L－1）：蔗糖50．0，酵母膏2．5，NaCl 1．0，

MgSO4·7H2O 0．2，K2HPO45．0，（NH4）2SO40．6，pH 值6．5。

以上培养基均于115℃灭菌30min。

1．2 方法

1．2．1 出芽短梗霉种子培养

从保藏斜面挑取一环出芽短梗霉As3．933菌种接种于装有50mL液体种子培养

基的锥形瓶中，于230r·min－1、28℃培养48h。

1．2．2 发酵培养产普鲁兰多糖

将种子液以5%（2．5mL）接种量接入装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，

于230r·min－1、28℃培养120h。

1．2．3 生物量和多糖含量的测定

将发酵液于6000r·min－1离心15min，沉淀用水洗涤2次后，105℃烘干至恒重。向上清液中加入2 BV无水乙醇，振荡摇匀，4℃放置12h，10 000r·min－1离心5min，沉淀于80℃烘干至恒重，即得普鲁兰多糖粗品，称量。

1．2．4 Plackett－Burman实验设计

根据单因素实验结果，以粗普鲁兰多糖产量为指标进行Plackett－Burman实验

设计。选择实验次数N＝12，对蔗糖（X1）、（NH4）2SO4（X2）、酵母膏

（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、NaCl（X5）、K2HPO4（X6）和pH值（X7）7个因素进行考察，另外取4个虚拟项进行误差估计。每个因素取2个水平，高

水平编码为＋1，低水平编码为－1。各因素水平取值见表1。以普鲁兰多糖产量

为响应值，每组3个平行，取平均值。用Design－Expert 8．0进行数据处理。

表1 Plackett－Burman实验因素与水平／g·L－1Tab．1 Factors and levels of Plackett－Burman experiment／g·L－1X1．蔗糖50 75 X2．（NH4）2SO4 0．6 0．9 X3．酵母膏 2．5 3．75 X4．MgSO4·7H2O 0．2 0．3

X5．NaCl 1．0 1．5 X6．K2HPO4 5．0 7．5 X7．pH 值6．25 6．75 1．2．5 最陡爬坡实验

最陡爬坡实验以Plackett－Burman（PB）实验的实验值变化方向为爬坡方向，

根据PB实验结果设计步长，尽快逼近最大响应区域。

1．2．6 响应面分析

在最陡爬坡实验结果的基础上进行3因素3水平实验，利用Design－Expert 8．0软件优化培养基组成。

2 结果与讨论

2．1 Plackett－Burman设计方案与结果

Plackett－Burman实验设计及结果见表2，各因素效应及显著性分析见表3。

由表3可知，对普鲁兰多糖产量产生正效应的因素为蔗糖、MgSO4·7H2O、NaCl 和 K2HPO4，产生负效应的因素为（NH4）2SO4、酵母膏和pH值。而可信度在95%水平上时酵母膏、（NH4）2SO4和 K2HPO4差异显著。

2．2 最陡爬坡实验

Plackett－Burman 实验结果表明，（NH4）2SO4（X1）、酵母膏（X2）为负效应，K2HPO（X3）4为正效应根据效应大小决定步长、其它因素分别取中心点水平，进行最陡爬坡实验。最陡爬坡实验设计与结果见表4。

表2 Plackett－Burman实验设计与结果Tab．2Design and results of Plackett－Burman experiment1 －1 1 1 1 －1 1 1 18．573 2 1 －1 1 1 －1 1 －1 19．873 3 －1 －1 1 1 1 －1 1 17．769 4 －1 1 －1 －1 －1 1 1 19．642 5 1 1 1 －1 1 1 －1 18．609 6 1 －1 1 －1 －1 －1 1 18．929 7 1 1 －1 1 1 －1 1 18．913 8 1 －1 －1 －1 1 1 1 22．480 9 －1 1 1 －1 1 －1 －1 17．429 10 －1 －1 －1 1 1 1 －1 22．127 11 1 1 －1 1 －1 －1 －1 19．749 12 －1 －1 －1 －1 －1 －1 －1 19．833

表3 Plackett－Burman实验结果分析Tab．3Significance analysis of Plackett －Burman experimentX1．蔗糖1．37 0．244 4 X2．（NH4）2SO4 －