金黄色葡萄球菌检验与计数

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食品微生物学检验金黄色葡萄球菌

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血浆凝固酶实验
血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别接种到5 mLBHI和营养琼脂小斜面，36 ±1℃培养18 h～24 h 。取新鲜配置兔血浆0.5 mL ，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2mL～0.3mL ，振荡摇匀，置 36 ±1℃温箱或水浴箱内。每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36±1℃培养18 h～48h ，重复试验。
第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数
结果
列出完成实验所使用的所有步骤。切记要为步骤加编号。添加实验照片。
第三法金黄色葡萄球菌MPN计数
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。 MPN法原理与局限C:\Users\华侃\Desktop\MPN法的原理与局限性分析.pdf

金黄色葡萄球菌检验

所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。
金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。
整理课件
6
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
生物学特性 ——致病性
•金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： •a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 •b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； •c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 •d.耐热核酸酶 •e.肠毒素：引起急性胃肠炎。
有毒性，并使菌落产生黑色
✓ 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环
✓ 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。
整理课件
15
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
在BP平板上典型菌落为：圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm, 颜色呈灰黑色至黑色,有光泽, 常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。
整理课件
7
食品安全检验技术（微生物部分）金色葡萄球菌检验
•葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。 •当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10 小时即可相当数量的肠毒素。
利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（最高可耐受 15%的氯化钠），用7.5%氯化钠肉汤增菌。

6.金黄色葡萄球菌GB 4789.10-2016

定性检测——选择性增菌
• 步骤：称取25g样品至盛有225ml 7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的容器中，均质。液体样品量取25mL。 • 作用：1，复苏细菌； 2，选择性增菌 • 操作要点：1，准确称（量）取； 2，按标准要求时间温度培养
定性检测——平板划线分离
• 步骤：分别用接种环取培养液1环，划线接种于一个Baird-Parker平板和一个血平板（，于36±1℃分别培养18-24h（血平板）或4048h（ Baird-Parker平板） • 作用：以划线方式在琼脂平板上分离出单菌落，通过单菌落的菌落形态判别出具有典型形态的可疑菌落进行下一步生化及血清实验确定。 • 操作要点：1，保持用于划线平板表面干燥 2，必须在平板中画出单菌落 3，用于划线平板需要现配现用
2，涂布是，涂布棒不要接触平板边缘
• 选择合计菌落数在20-200的平板，计算典型菌落数。如果： • a)只有一个稀释度平板菌落数在20-200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上典型菌落； • b）最低稀释度平板的菌落小于20，计数该稀释度平板上的典型菌落。 • c) 某一稀释度平板的菌落大于200且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。
金黄色葡萄球菌的检测方法
• • • • • • GB 4789.10-2016 ISO 6888 FDA(BAM) online chapter 12 化妆品卫生规范 USP/BP/EP ……
GB4789.10-2016的主要变化
• 1.删除了英文名称 • 2.修改操作程序，删除了分离培养基血平板 • 3.删除了增菌液10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤（跟国际接轨，FDA，ISO等均无定性方法，且都使用7.5%氯化钠肉汤） • 4.修改葡萄球菌肠毒素检验为可选项

实验十二金黄色葡萄球菌

5.2 增菌和分离培养

5.2.1 将上述样品匀液于 36 ℃±1 ℃培养 18 h ～24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到 BairdParker平板和血平板，血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。Baird-Parker平板 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h～24 h 或45 h～48 h。

检样检样25g(mL)+ 225ml灭菌生理盐水，均质。
10倍系列稀释 36±1℃ 18～24h
选择3个连续的适宜浓度的样品匀液，接种BP平板
计数及血浆凝固酶试验
报告
金黄色葡萄球菌MPN计数

样品稀释接种和培养根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%NaCl 胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3 管，将上述接种物36℃±1℃培养，45h～48h。。用3mm接种环，从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种Baird－Parker平板，36℃±1℃培养， 45～48h。
典型菌落计数和确认
选择菌落数在20 cfu～200 cfu之间平板上的典型菌落计数最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上一倍稀释度平板上没有典型菌落，计数该级稀释度平板上的典型菌落；
典型菌落计数和确认
金黄色葡萄球菌计数

第二法 BP平板计数(AOAC ISO) 金葡含量较高的食品第三法 MPN计数金葡含量较低而杂菌含量较高

食品中微生物的检测金黄色葡萄球菌检验

防止食品污染
对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。
防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成
01
应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；
02
在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻底加热。
03
1、形态与染色：(staphylococcus aureus) 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。革兰氏染色阳性。附：金黄色葡萄球菌的显微照片金黄色葡萄球菌的染色照片金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片金黄色葡萄球菌的透射电镜照片
金黄色葡萄球菌的致病性
＊＊当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经过8～10小时即可产生相当数量的肠毒素，肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏。人摄食该菌污染的食物2～3小时后可引起中毒症状，它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。
01
此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：
溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；
杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；
02
金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。

11金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数法

第页共页检验日期：报告/样品编号：检品名称：型号规格：质量等级：判定标准：检验方法依据：□GB 4789.10-2010 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验（第二法）□其他检验项目：金黄色葡萄球菌标准规定：n= c= m= M=一、实验准备1、仪器设备生化培养箱编号：BSYJ-YQ- 高压蒸汽灭菌器编号：BSYJ-YQ-电子天平编号：BSYJ-YQ- 高压蒸汽灭菌器编号：BSYJ-YQ-显微镜编号：BSYJ-YQ- 均质器编号：BSYJ-YQ-其他编号：BSYJ-YQ-2、培养基生产厂家、批号及培养基配制见年月日培养基配制及高压记录。

二、实验步骤及结果实验地点：□微生物限度室□无菌室□生物安全柜环境条件：温度℃相对湿度% 沉降菌：局部cfu 操作间cfu样品处理：称取样品25□g至下列液体中，供试液□充分振摇（8000 r/min处理 2 min）混匀；□ml □置均质器225ml □磷酸盐缓冲液或□0.85%生理盐水，制成1：10的样品匀液，吸取1ml至9ml □磷酸盐缓冲液或□0.85%生理盐水中,做10倍递增稀释；选、和三个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度以0.3ml、0.3ml、0.4ml接种三块Baird-Parker琼脂平板，用无菌L棒涂布整个平板，培养时间为日时至日时°C；第页共页结果计算公式：T = A B / C dT——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A——某一稀释度典型菌落的总数；B——某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C——某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d——稀释因子。

结果： n= c= 结论：。

金黄色葡萄球菌标准物质的定值方法

购自北京陆桥。
２）用镊子取下丁基胶塞，倒置放于桌面；３）加入７ｍＬ无菌水对冻干物进行溶解，静置
２ｍｉｎ；
４）加入９ｍＬ无菌水，盖上丁基胶塞，于涡旋仪
上高速混匀１ｍｉｎ．制成体积比１：２的菌悬液原液；
１．１试验样本
别加入到３个平板中（根据ＧＢ４７８９．１０ — ２０１０规定），用无菌三角推棒将菌液涂布整个平板，静置
试验样本（含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质），批次编号为ＪＰ０２１２，由作者所在实验室提供。样品检测前进行了均匀性和稳定性试验，在随后统计分析与评价中可以忽略样品不稳定性和不
的琼脂计数培养基。摇匀。待平板冷却凝固后，在（３６＋１）ｏＣ下倒置培养１８～２４ｈ；２）ＢＰ倾注法：吸取１ｍＬ制备的菌液稀释液，倾注入１５ｍＬ冷却至４２℃的ＢＰ培养基，摇匀。待平板冷却凝固后，在（３６￣１）℃下倒置培养ｌ８～２４ｈ；３）ＢＰ平板涂布法：取３片制好的ＢＰ琼脂平板，将制备的菌液稀释液以０．２、０．３、Ｏ．４ｍＬ的量分
１）用酒精棉球擦拭冻干瓶丁基胶塞，待冻干物

6.金黄色葡萄球菌GB 4789.10-2016解析

定性检测——平板划线分离
菌落形态：白色或者金黄色菌落，周围有透明溶血环（β-溶血）。主要成分：蛋白胨，牛肉粉，脱纤维羊血
注意点：一，使用前观看平皿是否有干裂或染菌；
二，开封后未使用完的培养基要及时放于冰箱保存。
定性检测——血浆凝固酶鉴定试验
• 步骤：可疑菌落+5mLBHI→ 36 ℃±1 ℃培养18-24h； 0.5mL兔血浆+0.2-0.3mL BHI培养物→ 36 ℃±1 ℃ 培养6h；每半小时观察；同时设置阳性（如：ATCC 6538)、阴性（如：表葡 ATCC 12228) • 阳性现象：试管倾斜或倒置时，呈现凝块，即凝固注意点：现象， 1，必须每半小时观察；或凝固体积大于原体积的一半。 2，陈旧培养物（培养超过18-24h）或生长不良
平板计数法——计算
平板计数Байду номын сангаас——计算
• d)某一稀释度平板的菌落大于200且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20~200之间，按以下公式，计数该稀释度平板上的典型菌落。 T=AB/Cd
其中 T-----样品中金黄色葡萄球菌菌落数 A-----某一稀释度典型菌落总数 B-----某一稀释度凝固酶阳性菌落数 C-----某一稀释度用于凝固酶试验的菌落数
B1----第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性菌落总数 B2----第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性菌落总数 C1----第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落总数
C2----第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落总数
1.1------计算系数
d--------稀释因子（第一稀释度）
• 超级细菌：耐甲氧西林金葡（万古霉素）

金黄色葡萄球菌的检验

金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)一．金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。

普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。

二、培养基7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。

三、金黄色葡萄球菌的定性检测主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。

1.样品的处理和增殖培养：样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。

金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。

3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。

金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。

微生物检测技术-金黄色葡萄球菌检测

国内检测标准
GB 4789.10-2010
食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
GB/T 20944.32008
食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素的测定第3部分：黄曲霉毒素 M1的测定
GB/T 23511.42008
食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定第4部分：脱氢乙酸含量的测定
样品中的快速检测。
纳米技术
纳米材料如纳米金、纳米孔等在金黄色葡萄球菌检测中展现出巨大潜力，具有高灵敏度、低检测
限和快速响应等优点。
未来研究方向
开发更高效、特异性的检测方法
01
针对金黄色葡萄球菌的不同表型和基因型，开发更高效、特异
性的检测方法，提高检测的准确性和可靠性。
集成化与自动化
02
将多种检测方法集成于一体，实现金黄色葡萄球菌的自动化检
治疗方案的选择。同时，对于流行病学调查和疾病监测也具有重要意义。
05
CATALOGUE
金黄色葡萄球菌检测技术展望
新技术发展与应用
基因组学技术
利用全基因组测序技术，能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌，
并识别其耐药性和毒力基因。
生物传感器技术
生物传感器能够实时、快速地检测金黄色葡萄球菌，具有高灵敏度和特异性，适用于食品和环境
测，提高检测效率，降低人工误差。
多重耐药性研究
03
深入研究金黄色葡萄球菌的多重耐药性机制，为遏制耐药性的
传播提供科学依据和技术支持。
对公共卫生的影响与意义
保障食品安全
金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，通过改进检测技术，能够及时发现和控制食品中的污染，保障公众的食品安全。
预防疾病传播

实验金黄色葡萄球菌的检验

实验5 金黄色葡萄球菌的检验1 目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2 基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。

此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。

因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。

绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。

3 实验材料3.1 检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2 菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。

3.3 培养基 7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4 试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。

3.5 仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。

4 检样程序5 操作步骤5.15.1.1样品的处理称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。

若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。

5.1.2 增菌和分离培养5.1.2.1 将上述样品匀液于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。

金黄色葡萄球菌检验与计数,GB4789.10-2016及纸片法-JW

金黄色葡萄球菌的肠毒素
金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。
近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。
肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水，难溶于有机溶剂。
分离培养基
Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约2~3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。
血浆凝固酶试验
挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落 1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的β溶血环。
血平皿上的形态
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。
典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，菌落周围有完全透明溶血环。

食品安全国家标准金黄色葡萄球菌检验

食品安全国家标准金黄色葡萄球菌检验1 范围本标准规定了食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验方法。

本标准第一法适用于食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数。

2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3 恒温水浴箱：37 ℃～65 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 均质器。

2.6 振荡器。

2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。

2.9 无菌培养皿：直径90 mm。

2.10 L涂布棒。

2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

3 培养基和试剂3.1 7.5 %氯化钠肉汤：见附录A 中A.1。

3.2 血琼脂平板：见附录A 中A.2。

3.3 Baird-Parker 琼脂平板：见附录A 中A.3。

3.4 兔血浆纤维蛋白原（RPF）琼脂培养基：见附录A 中A.4。

3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录A 中A.5。

3.6 兔血浆：见附录A 中A.6。

3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.7。

3.8 营养琼脂小斜面：见附录A 中A.8。

3.9 革兰氏染色液：见附录A 中A.9。

3.10 无菌生理盐水：见附录A 中A.10。

第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。

图1 金黄色葡萄球菌检验程序5 操作步骤5.1 样品的处理称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。

金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析

按照现行的国标方法，金黄色葡萄球菌检测方法分为第一法定性检验、第二法平板计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品），以及第三法M P N 计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品）。

第一法定性检验过程包括样品处理、样品增菌、平板分离划线、初步鉴定、确证鉴定这5个步骤，整个流程全部完成至少需要5天时间。

第二法平板计数法包括5个步骤——样品稀释、样品接种涂布、典型菌和可疑菌计数、鉴定试验、结果计算，整个流程全部完成至少需要4天时间。

第三法M P N 计数法同样包括5个步骤，即样品稀释、样品增菌、平板分离划线、鉴定试验、查MPN 表确认结果，整个流程全部完成至少需要5天时间。

以下将对金黄色葡萄球菌的检测流程进行简单介绍，并对难点、注意事项进行梳理和讲解。

1 第一法：金黄色葡萄球菌定性1.1 样品处理固态和半固态样品：称取25g样品至盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤中，充分混匀。

液体样品：吸取25m L 样品至盛有225m L 7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。

1.2 样品增菌将上述样品匀液置于金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析□ 李留洋锐德检测技术（天津）有限公司重的感染。

该菌对营养的要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧。

容易受金黄色葡萄球菌污染的食品主要为乳制品、蛋及蛋制品、各类熟肉制品，其次是含有乳类的冷冻食品等，因此对于该菌的检验也被确定为食品致病性菌种检验中的重要项目。

图1 样品处理36±1℃的恒温培养箱中培养18~24h 。

1.3 平板分离划线该步骤是整个金黄色葡萄球菌检测环节中最重要的步骤之一，因为平板划线分离的效果决定了可疑菌落的判定和选择。

平板划线选择三分法或四分法则分离效果较好，更容易出现单菌落平板。

1.4 初步鉴定分离的培养基选用B a i r d -Pa r k e r 平板（B P 平板）和血平板。

结果显示，金黄色葡萄球菌在B a i r d -Pa r k e r 平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，菌落直径为2~3m m ，颜色呈灰黑色至黑色、有光泽，常有浅色（非白色）边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带，当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感；有时可见到不分解脂肪的菌株——除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同；从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其颜色常较典型菌落略浅，且外观可能较为粗糙，质地较干燥。

食品中金黄色葡萄球菌检验

式（2）
案例
T A1B1/ C1 A2B2 / C2其中Leabharlann 1.1d样品稀释液
10-1
10-2
典型菌落数
183
21
T：样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
用于做血浆凝固
A1：第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
5
5
酶菌落数
A2：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1：第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；血浆凝固酶阳性
二、金黄色葡萄球菌定性检测
注意事项
Baird-Parker平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏:提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠:生长促进剂亚碲酸盐:对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄:提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂:对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。
36±1℃， 24~48h
圆形，光滑突起，湿润，直径23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。
革兰氏染色
血浆凝固酶鉴别
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢
血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。
36℃±1 ℃
45h~48h
计数及血浆凝固酶试验
GB 4789.10-2016 金黄色葡萄球菌的检验第二法
报告
操作规程
样品稀释同菌落总数检验
选择合适稀释度接种涂布BP平板
三、金黄色葡萄球菌定量检测
样品处理
移1ml