某公司内部的CRISPR-Cas9操作流程

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基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤

基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。

它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。

CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。

以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。

识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。

目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。

2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。

修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。

crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。

合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。

3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。

转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。

转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。

4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。

为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。

最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。

5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。

最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。

此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。

总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。

通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。

基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享

基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享在现代生物学研究中，基因编辑技术的出现为研究人员提供了一种高效、精确、低成本的方式来研究基因功能和调控机制。

CRISPR-Cas9系统作为一种革命性的基因编辑工具被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗和农业改良等领域。

本文将为您介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程，并分享一些最佳实践。

CRISPR-Cas9基因编辑技术概述CRISPR-Cas9是一种依靠细菌天然的免疫机制发展而来的基因编辑技术。

CRISPR是一种特殊的DNA序列，可与Cas9酶一起，通过识别和切割DNA序列来精确编辑基因组。

CRISPR-Cas9系统的主要组成部分包括CRISPR RNA （crRNA）、转录单元结构化RNA（tracrRNA）和Cas9酶。

crRNA负责识别目标DNA序列，而tracrRNA将crRNA与Cas9酶结合起来形成活跃的CRISPR-Cas9复合物。

CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程1. 设计并合成RNA引导序列在使用CRISPR-Cas9进行基因编辑之前，首先需要设计并合成RNA引导序列。

该序列用于指导Cas9酶精确识别和切割目标基因组DNA。

合成的RNA引导序列通常由crRNA和tracrRNA合成而成，也可以合成一个融合的single-guide RNA （sgRNA）。

2. 构建CRISPR-Cas9载体CRISPR-Cas9基因编辑需要将Cas9酶和RNA引导序列导入目标细胞内。

可使用载体如质粒或病毒进行基因编辑构建。

选择合适的载体需考虑目标细胞类型、转染效率和所需编辑范围等因素。

将Cas9基因和RNA引导序列克隆至载体后，可通过转染或病毒介导转染等方法将其导入目标细胞。

3. 确定编辑效果在导入CRISPR-Cas9系统后，使用分子生物学方法来验证编辑效果。

例如，PCR、测序、Western blot或免疫组化等技术可以用于检测目标基因的突变、修复或敲除效果。

(仅供参考)某公司内部的CRISPR-Cas9操作流程

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程Protocol No. PT140726-1Protocol No. PT140726-11，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：pGK1.1U6 CACC G CAAA 4 55’ -5’3’-3’ -- ～20bp2，操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。

B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPR Design：/●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”Array根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp 的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明

CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明实验材料与方法一、细胞培养人宫颈癌细胞 HeLa，常规培养使用含 10% FBS 的 DMEM 培养基 ( 含 1.5 mg/L-Glutamine,100 U/mL Penicillin,100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2 饱和湿度培养箱中培养。

二、基因信息及双 gRNA 设计基因信息及分析1.hsa-mir-152 基因信息：pubmed2.hsa-mir-152 基因位于蛋白编码基因 COPZ2 内含子内，敲除hsa-mir-152 基因不会影响该蛋白编码3.hsa-mir-152 precursor 序列（87 bp）：TGTCCCCCCCGGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGCTCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTGGGCCCGGAAGGACC双 gRNA 设计使用在线 gRNA 设计软件在 hsa-mir-152 precursor 基因组序列两侧设计双 gRNA注：dgRNA 即为双 gRNA.三、慢病毒侵染实验材料及试剂DMEM 培养基 + 10% FBSD-Hank’s SolutionTrypsin-EDTA Solution96 孔板24 孔板Lentivirus- 病毒液（GenePharma）步骤靶细胞侵染实验1.靶细胞铺板：24-well，加入2.5×105 cells/well（根据细胞种类调整），0.5 mL 完全培养基，37℃，5% CO2 过夜；2.稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度 5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按 1:9 加入到稀释液中；3.移去 Step1 中细胞培养液，加入 Step2 稀释后的病毒液，同时建立对照（blank、negative），37℃，5% CO2 过夜；4.12~24 小时移去细胞侵染后的病毒液，加入 0.5 mL 完全培养基，37℃，5% CO2 过夜；5.根据细胞状态和类型，如果必要分出 1/3~1/5，加入0.5 mL 完全培养基，继续培养 24~48 小时，荧光倒置显微镜下观察结果。

CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程

CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程Puro 抗性浓度摸索实验将细胞如下图1稀释。

给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。

确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。

图1 抗性浓度摸索单克隆形成验证实验细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。

静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。

sgRNA 靶标设计根据基因序列信息，设计 sgRNA。

靶标位点序列信息确认PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。

图2 靶标序列扩增sgRNA克隆引物合成根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。

lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。

lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。

图3 质粒抽提酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。

选择2个样品送样测序。

图4 单克隆酶切验证病毒包装lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。

细胞转染配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。

阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。

几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。

阳性单克隆细胞株验证测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。

实验结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。

单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。

单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。

CRISPR-Cas9体系实验流程(2)

CRISPR-Cas9体系实验流程(2)一、材料试剂准备1）质粒：pSpCa9(BB)(AddgeneplamidID:42230)，若实验用gRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。

pUC19(Invitrogen,cat.no.15364-011)可用于构建gRNA，若用PCR 产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNAcarrier。

上述三种质粒，根据实验选择gRNA的表达方式（PCR产物/单载体系统/双载体系统）来确定具体使用哪种。

2）超纯水，DNae/RNae-free(LifeTechnologie,cat.no.10977-023) 3）高保真聚合酶，KapaHiFi(KapaBioytem),PfuUltra(Agilen)，HerculaeIIfuionpolymerae均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4）TaqDNApolymeraewithtandardTaqbuffer(NEB,cat.no.M0273S)用于一般检测。

5）QIAquickgele某tractionkit(Qiagen,cat.no.28704)6）QIApreppinminiprepkit(Qiagen,cat.no.27106)7）FatDigetBbI(BpiI)(Fermenta/ThermoScientific,cat.no.FD1014)，如需要将gRNA构建到pSpCa9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。

8）T7DNAligaewith2某rapidligationbuffer(Enzymatic,cat.no.L602L).或者T4DNAligae，二者无区别。

12）T4polynucleotidekinae(NewEnglandBioLab,cat.no.M0201S)13）PlamidSafeATP-dependentDNae(Epicentre,cat.no.E3101K)14）Adenoine5′-triphophate,10mM(NewEnglandBioLab,cat.no.P0756S)15）SOCmedium(NewEnglandBioLab,cat.no.B9020S)二、实验流程或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为targetite，一般targetite可选在正义链或者反义链，二者均可。

crispr-cas9复合体构建流程

crispr-cas9复合体构建流程1.为了构建CRISPR-Cas9复合体，首先需要设计和合成cas9核酸序列。

In order to construct the CRISPR-Cas9 complex, it is necessary to design and synthesize the Cas9 nucleic acid sequence.2.接着需要选择适当的crispr RNA或gRNA序列，与cas9相结合以指导靶向基因组的位置。

Then, an appropriate CRISPR RNA or gRNA sequence needs to be selected to guide the Cas9 to the targeted position in the genome.3.将设计好的cas9和crispr RNA或gRNA序列合并形成合成DNA 片段。

The designed Cas9 and CRISPR RNA or gRNA sequences are combined to form a synthetic DNA fragment.4.制备好的合成DNA片段需要进行定向克隆到适当的表达载体中。

The prepared synthetic DNA fragment needs to be directionally cloned into an appropriate expression vector.5.表达载体通常需要包含启动子、编码区和终止子，以确保目标基因能够被正确表达。

The expression vector usually needs to contain a promoter, coding region, and terminator to ensure proper expression of the target gene.6.将构建好的表达载体转化到大肠杆菌或酵母等宿主细胞中。

CRISPR实验流程

CRISPR实验流程CRISPR/Cas9 实验流程交流企鹅: 2621697472（大家做哪块？）一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1 确定待敲除基因的靶位点1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）1.3 构建表达sgRNA的质粒1.4 sgRNA活性检测1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。

找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。

按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。

对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。

如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。

1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。

一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。

而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。

因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。

不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。

因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。

CRISPR流程

1. 设计Oligo DNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPR Design：/●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

CRISPR及Cas9基因编辑技术具体步骤及方法

CRISPR/Cas9基因编辑技术具体步骤及方法CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。

其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous Recombination, HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

CRISPR基因敲除利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成：1. 单链的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA，并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA（图1）。

当基因组发生双链DNA 断裂后，细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合，在此过程中，将随机引入N 个碱基的缺失或增加，若N 非3 的倍数，则目的基因发生移码突变，实表1 CRISPR/Cas9 基因敲除与RNAi 比较CRISPR过表达利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件，形成一种蛋白复合物-协同激活介质（SAM），可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。

该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。

CRISPR-SAM 系统由三部分组成：1. 失去核酸酶活性的dCas9（deactivated Cas9）-VP64 融合蛋白2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM，全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器)，这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。

CRISPRCas9基因合成操作步骤及详细说明

CRISPRCas9基因合成操作步骤及详细说明本文档将详细介绍CRISPRCas9基因合成的步骤与操作说明。

步骤一：设计引物在进行CRISPRCas9基因合成之前，首先需要设计合适的引物。

引物应包括靶标基因的DNA序列和与Cas9蛋白相结合的序列。

引物的设计可以借助各种基因编辑工具，如基因编辑软件和在线工具。

步骤二：引物合成和靶向序列放大根据设计的引物序列，可以选择商业实验室或合成生物学公司进行引物合成。

合成的引物可以通过PCR方法进行靶向序列的放大。

此步骤可通过以下步骤进行：1. 准备PCR反应体系，包括引物、PCR缓冲液、DNA模板和dNTPs。

2. 将PCR反应体系置于PCR仪中，进行适当的温度循环来放大靶向序列。

步骤三：提取和纯化靶向序列放大的靶向序列需要进行提取和纯化，以去除其他非目标DNA片段和杂质。

可以使用商业化的基因提取和纯化试剂盒来完成此步骤。

按照试剂盒的操作说明，将靶向序列提取和纯化至高浓度。

步骤四：CRISPRCas9系统装配在进行CRISPRCas9系统装配之前，准备如下材料：Cas9蛋白、sgRNA、纯化的靶向序列和核酸缓冲液。

1. 将Cas9蛋白与sgRNA按照一定的比例混合，使其形成复合物。

2. 加入纯化的靶向序列至Cas9-sgRNA复合物中，使其与靶向序列结合。

3. 将装配好的CRISPRCas9系统进行短暂的孵育，以便复合物形成稳定的结构。

步骤五：CRISPRCas9基因合成实验进行CRISPRCas9基因合成实验时，需准备以下实验材料：装配好的CRISPRCas9系统、细胞培养基、目标细胞。

1. 将目标细胞培养至合适的密度。

2. 通过转染或电穿孔等方法，将装配好的CRISPRCas9系统转导至目标细胞。

3. 维持目标细胞在适当的培养条件下，观察基因合成效果。

步骤六：结果分析与验证验证CRISPRCas9基因合成的有效性和准确性，可采取以下方法之一：1. DNA测序：通过对目标基因进行测序，确认其是否发生了改变。

CRISPRCas9基因编辑动物构建的基本流程？

针对特定基因序列利用软件sgrnadesigner预测潜在sgrna序列并依据实验要求挑选合适的靶点
CRISPRCas9基因编辑动物构建的基本流程？
① 针对特定基因序列，利用软件（sgRNA Designer）预测潜在 sgRNA 序列，并依据实验要求挑选合适的靶点；
② sgRNA 活性筛选，选出有活性且特异性高的 sgRNA；
③ 构建 sgRNA பைடு நூலகம்达载体，并利用 T7 体外转录试剂盒进行 sgRNA 体外转录；
④ 利用 SP6 转录试剂盒进行 Cas9 mRNA 体外转录；
⑤ 将 Cas9 mRNA 和 sgRNA 按合适浓度混匀，并进行受精卵显微注射；
⑥ 注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内继续发育；
⑦ 待子代小鼠出生后对其进行基因型分析。

crisprcas9操作流程

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基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南

基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南引言：基因编辑技术CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats–CRISPR associated protein 9）是目前最常用且最强大的基因编辑工具之一。

CRISPR-Cas9可以精确地修改细胞或生物体的基因组，并且具有广泛的应用前景，涵盖了从基础生物学研究到基因治疗的众多领域。

本文将为您提供一份操作指南，帮助您了解和掌握CRISPR-Cas9的基本操作步骤。

一、准备工作在使用CRISPR-Cas9之前，您需要做一些准备工作。

1.设计sgRNA（single guide RNA）序列：sgRNA可以指导Cas9蛋白靶向到目标基因的特定位点。

设计合适的sgRNA序列是成功编辑基因的关键。

您可以使用在线的sgRNA设计工具或参考已有的文献来选择合适的sgRNA序列。

2.制备合适浓度的Cas9蛋白：Cas9蛋白是CRISPR系统中负责切割DNA的关键因子。

您可以购买商业化的Cas9蛋白，也可以通过表达和纯化Cas9蛋白的方法进行制备。

确保蛋白质的浓度和纯度是进行CRISPR-Cas9实验的必要条件。

二、转染CRISPR-Cas9系统1.选择合适的细胞类型和培养条件：不同的细胞类型在转染CRISPR-Cas9系统时可能有不同的效率。

因此，选择合适的细胞类型和培养条件对于实现高效的基因编辑是至关重要的。

2.转染CRISPR-Cas9组分：将设计好的sgRNA序列和Cas9蛋白转染到目标细胞中。

您可以使用合适的转染试剂或方法进行转染。

确保转染试剂或方法的选择是适合您的细胞类型的，并根据试剂或方法的说明书进行操作。

三、基因编辑1.筛选和扩增转染细胞：在转染完CRISPR-Cas9系统后，您需要筛选和扩增成功转染CRISPR-Cas9系统的细胞。

您可以使用选择性培养基或标记基因来识别成功转染的细胞群体。

手把手教你搞定CRISPRCas9系统操作

⼿把⼿教你搞定CRISPRCas9系统操作今天我们邀请冰糖来介绍 lentiCRISPR v2 应⽤指南。

lentiCRISPR v2 说明克隆 gDNA 使⽤ BsmBI 位点，载体可以切出⼀个~1.9 kb 的 filler ⽚段，便于 confirm 酶切成功并利于载体回收。

BsmBI 的位点如图所⽰：酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会⾃连。

Cas9 的 COOH 端带有 FLAG tag, 可以 WB 或者 Immunostaining。

EFS promoter 被优化的⼩⽽强，极⼤提⾼了慢病毒包装的效率。

载体带有 Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。

参考⽂献：Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening. Sanjana NE, ShalemO, Zhang F. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi:10.1038/nmeth.3047. 10.1038/nmeth.3047 PubMed 25075903gDNA 设计说明gDNA 设计⽅法和原则请查看「CRISPR/Cas9 系统操作指南⼀」。

请加颜值担当菌菌，微信号：biotalk。

注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南⼀》。

对于 lentiCRISPR v2 克隆，其合成的 oligo 末端和 pX330 不同，请注意设计。

举个例⼦说明（千万注意 oligo 的⽅向）载体克隆说明1.Backbone 的酶切体系与⽂章「CRISPR/Cas9 系统操作指南⼀」⼀样，不脱磷处理参考图 1中的操作，脱磷处理参考图 2 中的操作。

2.Oligo 的退⽕条件也与⽂章「CRISPR/Cas9 系统操作指南⼀」⼀样。

注意：如果载体不脱磷，oligo 不需要磷酸化；载体脱磷参考图 2（FengZhang 提供的protocol，设计脱磷，可以参考），oligo 就需要加磷处理。

CRISPR-Cas9操作流程

基因编辑技术CRISPRCas9的操作步骤与技巧

基因编辑技术CRISPRCas9的操作步骤与技巧概述基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的基因工程方法，它使得科学家们能够准确、高效地修改生物体的基因组。

CRISPR-Cas9系统利用CRISPR序列指导Cas9酶进行DNA切割，并借助细胞自然的修复机制来实现精确的基因修饰。

本文将介绍CRISPR-Cas9技术的操作步骤，以及实验中需要注意的技巧和注意事项。

操作步骤：1. 设计合适的gRNA（引导RNA）序列：gRNA是用来指导Cas9酶精确切割特定DNA序列的RNA分子。

设计一个合适的gRNA序列是CRISPR-Cas9技术操作的第一步。

确保目标DNA序列位点的选择和gRNA序列的设计遵循一定的规则和原则，以提高操作的效率和准确性。

2. 合成gRNA和Cas9蛋白：合成合适的gRNA是CRISPR-Cas9技术的关键。

根据设计的gRNA序列，合成相应的gRNA。

同时，合成Cas9蛋白或利用表达载体将Cas9蛋白表达进入细胞中。

3. 转染gRNA和Cas9蛋白：将合成的gRNA和Cas9蛋白转染到目标细胞中。

可以使用合适的转染试剂和方法，如化学转染、电转染或病毒转染等。

确保gRNA 和Cas9蛋白能够成功地进入细胞内。

4. DNA切割和修复：一旦Cas9与gRNA形成复合物进入细胞核，Cas9便能够准确地识别和切割目标DNA序列。

DNA的切割会引发细胞内自然的修复机制，可以选择使用非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）来修复切割的DNA。

NHEJ修复机制常常带来插入缺失或错配，而HDR可以实现特定的DNA改造。

5. 筛选和检测：在进行CRISPR-Cas9基因编辑后，需要对细胞或生物体进行筛选和检测，以鉴定编辑效果和确认目标基因的改变。

可以利用PCR、Westernblot、DNA测序等方法验证基因的编辑和修饰效果，并在细胞或生物体水平进行相关功能性分析。

技巧和注意事项：1. 合适的gRNA选择：选择合适的gRNA序列对于CRISPR-Cas9技术的成功应用至关重要。

CRISPR-Cas9全程实操教程：从gRNA设计到挑单克隆全程指导

CRISPR-Cas9全程实操教程：从gRNA设计到挑单克隆全程指导CRISPR-Cas9全程实操教程：从gRNA设计到挑单克隆全程指导基本原理CRISPR-Cas9是⼀种细菌获得性免疫，⽤于降解⼊侵的外源DNA。

CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA) 退⽕形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在⽬的⽚段⽣成DNA双链断裂，如下图所⽰。

通过基因⼯程⼿段对crRNA和tracrRNA进⾏改造，将其连接在⼀起得到sgRNA (single guideRNA)。

通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对⽬的基因进⾏基因操作，在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进⾏切割，如下图所⽰。

因此本实验的关键步骤是设计⼀对20bp（不包括NGG在内的）完全互补的oligo插⼊到如上图所⽰的filler。

另U6启动⼦需要5’端的G起始转录，因此若设计的oligo第⼀个碱基⾮G，需额外增加⼀个G。

操作详细流程1. 设计sgRNA关于sgRNA的设计我们有专门开过⼀篇⽂章《⼀⽂掌握gRNA的设计，常⽤⽅法汇总解析》[点击此处阅读]确定靶基因的序列，可通过在线⽹站设计( )，或根据靶基因的CDS序列⾃⾏设计，最⽅便的是在human KO Library sgRNA⾥选择。

⽆论选择哪种⽅式，都建议进⾏⼀下blast。

附上在线设计⽹页截图。

输⼊基因的name，填写email address，设计结果稍后会发送到此邮箱，选择序列的类型以及物种。

如sequence type选择unique region，⼀次只能输⼊23~500bp序列跨越内含⼦，都选择键⼊后点击的基因⽚段，最好⼀次只输⼊⼀个外显⼦，避免最好⼀次只输⼊⼀个外显⼦，避免guide序列跨越内含⼦提交，关注邮箱或者在线等。

CRISPRCas9基因删除操作步骤及详细说明

CRISPRCas9基因删除操作步骤及详细说明1. 简介CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，可以精确地修改和删除DNA序列。

本文档将详细介绍基因删除操作的步骤和相关说明。

2. 操作步骤步骤一：设计CRISPR引物- 根据目标基因序列设计CRISPR引物，引物应能够与目标基因准确结合，以便Cas9酶与目标基因形成复合物。

- 引物的设计应考虑到目标基因的特异性和目标区域的一致性。

步骤二：合成sgRNA- 合成单导RNA（sgRNA）用于将Cas9酶引导到目标基因上。

sgRNA通常由两部分组成：CRISPR RNA（crRNA）序列和转导RNA（tracrRNA）序列。

- 将两部分RNA序列合成并连接，形成sgRNA。

步骤三：合成Cas9蛋白- 合成Cas9蛋白，可以通过表达Cas9基因或在细胞外进行蛋白表达来获得Cas9蛋白。

- 确保合成的Cas9蛋白具有高活性，以确保其在基因编辑中的有效性。

步骤四：转染CRISPR-Cas9系统- 将合成的sgRNA和Cas9蛋白转染到目标细胞中。

- 转染方法可以根据目标细胞类型选择合适的方法，如细胞病毒转染、电穿孔或化学转染等。

步骤五：靶向基因编辑- Cas9蛋白与sgRNA形成复合物，定位到目标基因的特定位点。

- Cas9蛋白通过识别特定位点上的核酸序列，引导其内部的核酸酶活性，切割目标基因的DNA序列。

- 当DNA序列被切割后，细胞的自修复系统会介入修复切割部位，导致目标基因发生缺失或错义突变。

步骤六：验证基因删除- 使用PCR或DNA测序等方法验证基因删除是否成功。

- 可以设计引物来扩增目标基因的特定区域，然后通过测序检测目标基因序列的变化。

3. 注意事项- 在进行CRISPRCas9基因删除前，需充分了解目标基因的功能和相关影响。

- 确保所有实验操作符合生物安全和伦理要求。

- 结果分析时，注意排除非特异性效应和离靶效应。

以上是CRISPRCas9基因删除的操作步骤及详细说明。