(医学课件)IPP分析免疫组化图片
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免疫组化PPT课件
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28
未封闭内源性过氧化物酶
29
30
胃固有膜腺体
31
3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
32
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
58
59
60
61
62
63
64
抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
12
（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
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未封闭内源性过氧化物酶
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30
胃固有膜腺体
31
3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
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59
60
61
62
63
64
抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
IPP-分析免疫组化图片 ppt课件
25
2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
PPT课件
26
2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
PPT课件
15
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
PPT课件
16
使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
PPT课件
17
对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
PPT课件
9
1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
PPT课件
10
比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
PPT课件
11
这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
PPT课件
8
1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
免疫组化课件PPT课件
李
三 华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室 李 三 华
二 免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验 室 李 三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全 离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心 实 验 室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其
免疫组化PPT精选课件
20
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
IPP 分析免疫组化图片(共61张PPT)
民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自 动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片， 这些功能却会改变照片的原始面貌，而且它对每一张照片都使 用了不同的拍摄条件。严重影响照片的分析测量结果。要想关 闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。
各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证 它们的曝光一致。
控制相机曝光时间
要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。
拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过 高。
在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
使用IPP比前两种方法更好。
IODdensi(txy, y)ds 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。
右上角的空白区面积应该扣除。 整张图片所有对象的IOD累加值（IOD SUM）
所以最后的分析测量结果依然属于半定量分析。
1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
背景
无显著性 差异
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
0
阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证 它们的曝光一致。
控制相机曝光时间
要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。
拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过 高。
在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
使用IPP比前两种方法更好。
IODdensi(txy, y)ds 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。
右上角的空白区面积应该扣除。 整张图片所有对象的IOD累加值（IOD SUM）
所以最后的分析测量结果依然属于半定量分析。
1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
背景
无显著性 差异
背景+阳性样品 背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
0
阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1
用Image-pro_plus（IPP）分析免疫组化图片
⽤Image-pro_plus（IPP）分析免疫组化图⽚⽤Image-pro plus（IPP）分析免疫组化图⽚免疫组化的定量研究的理论上是可⾏的，但是实际应⽤起来影响因素太多。
国外基本上没有对免疫组化定量的，最多只是半定量研究。
建议只⽤免疫组化做定性和定位研究。
但是⽬前关于免疫组化蛋⽩定量分析也⽐较多⽽且使结果更加直观，简单介绍⼀下使⽤⽅法和注意事项，共同学习。
⽤IPP分析免疫组化图⽚过程选取图⽚上具有染料⾊调的区域（AOI，area of interesting）?测量该区域的IOD。
选择并测量有效统计区域的⾯积计算选择区域内的光密度平均值IOD/area（density mean）计算同⼀实验组切⽚各照⽚的平均及标准差。
⽤统计学⽅法分析各实验组的平均density mean之间是否有显著性差异。
拍照注意事项：正确调整显微镜光源为⽇光⾊温的⽩⾊光。
此时是加蓝⾊滤光⽚，灯丝电压为10V左右。
⼀般的显微镜上都会有指⽰的。
此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。
不能通过调整光圈的⽅法减低亮度，这会影响到图象的清晰度。
光圈与聚光镜要按照柯勒⽅法调整以保证照⽚的清晰.不能加过⼤的灰度镜减低亮度。
⽤25%的灰度滤光⽚还⾏。
6%的灰度滤光⽚会导致⾊彩失真。
如果照明光源不⽩，有偏⾊，将直接影响到照⽚⾊彩，从⽽使得测量结果不准确。
为保证显微镜光源的稳定⼀致，所有照⽚应该⼀次拍摄完成。
不能分数次拍摄。
若能给显微镜加上稳压电源就更好了。
这能保证显微镜光源亮度的稳定。
要把相机曝光时间控制到使视野中空⽩的地⽅呈现纯亮的⽩⾊。
拍摄出的照⽚上，没有组织的空⽩处的背景灰度值应达到230左右可以使⽤图象分析软件测量⼀下空⽩处的背景灰度值。
低于230的背景灰度值很容易产⽣⾊彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。
把空⽩灰度值调到230相当于在分光光度计上调节100%透射。
免疫组化阳性细胞计数⽅法：image pro plus 6.0软件1.打开图⽚，点击count and measure objects 图标2.点击measure3.点击select measurement4.选中area。
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随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？
27
2.3 ImagePro plus的独特优势。
准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密 度参数。
28
使用IPP比前两种方法更好。
在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。
8
1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
7
用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起
OD值是一个没有单位的相对值。 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。
对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲 线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指 数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一 个标准点进行定量分析是不准确的。多个标 准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说 是半定量分析。
255
4
Optical Density: 吸光物质的光学密度.
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物 质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0-2.0或者0-3.0。
24
2.从图片上分析光密度方法 的技术进步
简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区
域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
25
2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
9
1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
10
比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
11
这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
12
比较体积！
IOD density(x, y)ds
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
5
用OD值是正确的
分光光度计与酶标仪的测定值是OD值 透射的显微镜图象上的光强度要用OD值 蛋白电泳条带的测量也是OD值。 萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度
(Fluorescence intensity) 用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处
理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面 的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映 着荧光物质的多少。
6
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值 来表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个 OD值，光密度。不应该是灰度。
准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域 的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度 值。
S
density(mean) IOD / area
光 密 度
尺寸
13
1.4 实际图片的情况很复杂的。
阳性样品染色深，阴性样品染色浅。
14
直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density
15
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
16
使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
21
对单个细胞的分析比较
单个细胞的IOD 单个细胞的mean density 照片上各细胞IOD或mean density的平均值
22
边界不清晰的贴壁细胞
整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）
23
细胞簇的分析
测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N ）作为统计指标。或IOD/area
光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与 染色物质的量相关的。
灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子 照片上像素的亮度称为灰度。
3
Gray: between white and black
Example: 1.The bright value on display screen is gray value. 2.The dark value on a white paper is also the gray value.
用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫组化图片
1
1.免疫组化图片分析原理
根据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确 定目标蛋白的量。
染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。 染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合
朗伯-比尔定律，是对数关系。
2
ห้องสมุดไป่ตู้
1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
17
对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
18
右上角的空白区面积应该扣除。
19
也许应是这个特定的组织区域
20
这个区域是特定染色的区域。在计算 IOD时能同时计算出来，但以此为平 均面积往往并不正确。
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2.3 ImagePro plus的独特优势。
准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密 度参数。
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使用IPP比前两种方法更好。
在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
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用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起
OD值是一个没有单位的相对值。 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。
对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲 线。 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指 数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一 个标准点进行定量分析是不准确的。多个标 准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说 是半定量分析。
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Optical Density: 吸光物质的光学密度.
被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。
OD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物 质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。
理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0-2.0或者0-3.0。
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2.从图片上分析光密度方法 的技术进步
简单测量整张照片的光密度值。 在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
计算其平均值作为整张照片的光密度值。 在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区
域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。
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2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
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1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
10
比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
11
这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
12
比较体积！
IOD density(x, y)ds
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
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用OD值是正确的
分光光度计与酶标仪的测定值是OD值 透射的显微镜图象上的光强度要用OD值 蛋白电泳条带的测量也是OD值。 萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度
(Fluorescence intensity) 用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处
理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面 的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映 着荧光物质的多少。
6
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值 来表示。
所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个 OD值，光密度。不应该是灰度。
准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域 的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度 值。
S
density(mean) IOD / area
光 密 度
尺寸
13
1.4 实际图片的情况很复杂的。
阳性样品染色深，阴性样品染色浅。
14
直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density
15
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
16
使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
21
对单个细胞的分析比较
单个细胞的IOD 单个细胞的mean density 照片上各细胞IOD或mean density的平均值
22
边界不清晰的贴壁细胞
整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）
23
细胞簇的分析
测量整张图片黄色区域IOD。 再测量细胞分布的区域面积 area。 对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。 以 IOD /（N ）作为统计指标。或IOD/area
光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与 染色物质的量相关的。
灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子 照片上像素的亮度称为灰度。
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Gray: between white and black
Example: 1.The bright value on display screen is gray value. 2.The dark value on a white paper is also the gray value.
用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫组化图片
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1.免疫组化图片分析原理
根据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确 定目标蛋白的量。
染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。 染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合
朗伯-比尔定律，是对数关系。
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1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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右上角的空白区面积应该扣除。
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也许应是这个特定的组织区域
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这个区域是特定染色的区域。在计算 IOD时能同时计算出来，但以此为平 均面积往往并不正确。