超氧阴离子自由基荧光探针的研究进展
超氧阴离子自由基和过氧亚硝酸根离子荧光测定法的研究
山东农业大学硕士学位论文是常用的化学发光剂。
在有氧、Ｈ２０２、Ｏｚ＇－以及其它过氧化物存在下，化学发光可以被氧化，产生电子激发态的中间产物，当其返回基态时，即产生化学发光（李益新等，１９８６）。
Ｇｌｅｕ和Ｐｅｔｓｅｈ两人（ＢｕｒｒＪＧ１９８５）在碱性条件下，光泽精与０２·。
等氧化物作用生成激发态Ｎ．甲基吖啶（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ）并发出波长５２３ｎｎｌ的微弱光。
它对活性氧的测定选择性比较高，许多报道（ＧｏｔｏＨｅｔａ１．，１９９８；ＨｉｐｌｅｒＵＣｅｔａ１．，）光泽精只有在超氧自由基存在下发生发光现象。
Ｃｈｏｉ等（ＣｈｏｉＨＹ，２００１）在黄嘌呤．黄嘌呤氧化酶体系产生０２·‘的基础上，建立了流动注射化学发光法测ＳＯＤ活性，流动相为含有５岬ｏｌ·Ｌ－１光泽精和Ｏ．３ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄嘌呤的５０ｍｔｏｏｌ·Ｌ－１磷酸钾缓冲溶液（ｐＨ７．４）。
牛血清蛋白在１．１０００ｇ．ｍＬｏ的范围内不影响测定，可在３０ｓ内测定一份样品。
但样品中抗坏血酸等还原性物质会影响ＳＯＤ活性的测定。
Ｙａｏ等（ＹａｏＤｅｔａ１．，２００２）用ＤＭＳＯ和氯化四丁基铵（ＤＭｓ０一ＴＢＡＣ）溶液提取鼠不同组织中的超氧自由基，用鲁米诺加强化学发光反应检测。
由于其它的活性氧物质反应（ＲＯＳ）引起的背景干扰被降到了最小，实验达到了最佳检测条件。
用此体系评估了在中国用大量干腌肉喂养的鼠体内的超氧自由基的水平，评估结果在１０一．１０。
１ｔｏｏｌ·Ｌ．１之间，表明喂养干腌肉的鼠体内的超氧自由基的量比正常组的鼠要高的多，会引起组织损伤。
孙涛等（孙涛等，２００６）采用流动注射化学发光技术，在邻苯三酚自氧化体系体系中，优化了检测超氧阴离子自由基的方法，通过对测定条件的研究，得到了测定的最佳方案，证明了方法的可行性和重现性。
刘绪峰等（刘绪峰等，２００６）用化学发光法检测了Ｃ６０与吡咯烷衍生物对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子的清除效果。
荧光探针检测活性氧的研究进展
代一 一２ （ 苯基磷） Ｎ（ － 一 乙基）２ 一 一 Ｈ 苯吡喃一 一 ３ 甲酰胺 。 通过显微 注射技术或将探针转化 成可 以穿透细胞 膜的对应的脂类衍生物的方法 ， 以使其具备检测 可 生物系统中的过氧化氢的能力 。 在黄嘌呤／ 黄嘌呤氧 化物／ 超氧歧化酶条件下 ， 探针可 以检测出微摩尔浓 度级的过氧化氢 。 过氧化氢是导致荧光强度增加的
面 的进 展 情况 。
关键词 ：活性氧
荧光探针
过氧化氢
单线态氧
超氧 阴离子
羟基 自由基
中圈分类号： Ｓ ０ Ｔ １５
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ： ０９ ５６ （０ ８ －０４ －０ １０ － １０ ２０ ） ０ １ ３
和很高的灵敏度 ，即对 于需要检测的活性氧反应性
很 强 ，而 对 于其他 活 性 氧则 反应 较 弱 ，甚 至 不能检
主要原 因，过氧歧化酶会使荧光强度降低 ，而过氧 亚 硝 酸 阴离子 ，羟基 自由基 ，脂 质 过氧 化物 对 于检
测 的干 扰 可 以忽 略 。
在吗啉代丙烷磺酸（ Ｏ Ｓ Ｍ Ｐ） 缓冲液条件下 ， 过氧 化 氢可以和 Ｅ 四环素络合物水溶液作用生成具 一 有强烈荧光的化合物 ， ｌ ｅ 等囝 Ｗｏｂｉ ｆ ｓ 据此反应设计出
借助 的是吸收理论 ，检测的灵敏度并不高 。 Ｕ ｅａ ａ等ｐ Ｄ Ａ 的活性部分 与荧光素融 ｍｚ ｗ 将 Ｐ
合， 合成 出检 测探 针 ： 一２ （ 一 基 一 ， 一 苯基 ） ９ 『一 ３羧 ９１ 二 ０
蒽基 １６ 羟 基一 Ｈ一 —一 ３ 氧杂 蒽一 一 ￣Ｄ Ａ ） ３ ｆ （Ｐ Ｘ 。该探 针 和 ｌ ］
胞内羟基自由基和超氧阴离子自由基测定
活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。
目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。
其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。
细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。
然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。
此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。
因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。
胞内羟基自由基测定机理：2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。
这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。
尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。
因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。
此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。
胞内羟基自由基测定方法：在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。
用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。
胞内超氧阴离子自由基测定机理：一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。
DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。
根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。
超氧化物阴离子荧光探针
超氧化物阴离子荧光探针
超氧化物阴离子荧光探针是检测和监测细胞氧化应激的有用的生物标记物。
它的应用不仅在药物研究领域受到广泛关注，还在高校与高等教育中有所作为。
超氧化物阴离子荧光探针是一种基于配体技术，它通过识别阴离子来实现，也可以用于检测和跟踪活性氧。
该技术可以检测正常细胞通常称为转氧单胞菌中的超氧化物阴离子，如过氧化氢、过氧化物和醛类分子。
他们都具有活性，有效地抑制细胞的正常功能。
当氧化应激发生时，超氧化物阴离子就会出现，测量一个细胞或细胞群体的超氧化物阴离子水平就可以反映出氧化应激的程度。
在高校和高等教育中，超氧化物阴离子荧光探针通常用于检测和监测细胞氧化应激，其中有一种称为Role OF ROS（细胞氧化应激角色）的方法可以帮助检测出氧化应激引起的负面影响，比如细胞早衰、炎症反应等。
超氧化物阴离子研究在高校和高等教育中受到大量关注，以及评估其在具体应用中的有效性。
当前，超氧化物阴离子荧光探针的最新进展可以发挥多重作用，不仅能够精准检测细胞氧化应激，而且还可以增强诊断和治疗效果，如显示出ROS诱导的抗肿瘤治疗有助于阻断癌症发展。
在高校中，超氧化物阴离子荧光探针能够帮助专业人员更好地理解氧化环境与细胞组织，进而做出正确的选择。
超氧化物阴离子荧光探针是药物研究和高校教育领域的重要工具，它以准确的信号强度测量细胞氧化应激的重要参数，因而是研究细胞的有效途径。
从氧化应激影响的分子机制和潜在的病理生物学机制，超氧化物阴离子荧光探针能够在高校中有一定的重要作用。
超氧阴离子自由基电化学分析的新进展
如图3所示,Tian课题组[43首次在锥状、棒状和球状3种不同形貌的纳米金表面上同时实现了SOD的直接电化学。热力学和动力学分析表明SOD在不同界面上的电子转移速度，与纳米金的形貌有关Or分别转化成Oi和&O2(如图4A)。此过程可看成是分别在两个电极上独立进行的两个反应。一方面,在阳极反应中图（4B),电解液中的被MnOi+的氧化生成O2,同时MnOi+被还原成Mn2+。而生成的Mn2+能够在电极上失去电子，重新被氧化成MnO2+。另一方面，在阴极反应中（图4C),O；-氧化Mn2+生成MnO2+,而生成的MnO2+在电极表面得到电子被还原成Mn2+。因此,在O〗-存在的情况下,通过Mn2+修饰电极上的氧化或还原电流检测O2’_。因此,通过两极上氧化或还原电流信号的变化，即可实现对O2’_的检测。电化学信号表明此生物传感器可以实现细胞应激反应产生0厂自由基的可逆响应，暗示02’_自由基可作为_种癌症生物标记物，为生理和病理方面的研究提供了基础。
环境来实现其直接电子传递,致使阻碍其在活体检测方面的实际应用。通过界面设计使修饰电极可以建立理想的接触界面,暴露酶的电活性中心，实现酶与电极之间快速的直接电子传递,并利用其对自由基的选择性达到预期的检测目的，对于预防和治疗疾病以及抗氧化药物的研发都具有现实意义。
DHE超氧化物阴离子荧光探针
Dihydroethidium (DHE)—超氧化物阴离子荧光探针呼~深吸一口气，你感受到了什么？饱含O2的气流，进入肺部，通过交换进入血液，再运输至全身各处，于是一种愉悦的情绪开始从身体内部升起、蔓延……这种深呼吸带来的安定感，除了供氧充足外，还没有给出特别合理的解释，只有斯坦福大学的一支团队给我们带来了一点启示，他们发现在小鼠脑干深处，有一群微小的神经元集群，它们将呼吸与放松、关注、兴奋和焦虑联系起来，连结着大脑的唤醒中心，可调节情绪状态。
这个发现也许能给呼吸与情绪的关系带来一定的启发，毕竟呼吸是那么的重要，它伴随着我们的一生，当然，任何过程都伴随着小小的隐患。
一个成年人一天大概需要0.75公斤的O2，氧分子在代谢过程中可能被单个电子还原，形成中间产物超氧阴离子O2-，其性质活泼，易与多种大分子结合使其失去活性。
生物体正常代谢过程和在各种环境胁迫下均能产生超氧化物，它们的积累将引起生物体内细胞结构和功能的破坏。
人体内正常有一套活性氧清除系统，但在某些疾病的影响下，会出现氧化应激现象（即氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化），超氧化物增多，所以在科研及疾病诊断中可以通过检测超氧化物的含量，来反应呼吸及疾病程度。
为此我们需要用到可以特异性识别超氧化物的产品——Dihydroethidium (DHE)就是我们今天的主角。
Dihydroethidium (DHE)是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针,能有效地检测活性氧类。
这种染料可以自由地进入细胞，在细胞内超氧化物阴离子作用下脱氢形成溴化乙锭。
溴化乙锭可以与RNA或DNA结合产生红色荧光。
当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的溴化乙锭较多，红色荧光就较强，反之则较弱。
这样就可以用二氢乙锭进行超氧化物阴离子水平的检测。
在下面这篇文章中我们可以看到具体的DHE的应用。
这是一篇探究体外培养的CD34+细胞在缺氧和常氧状态下，抗氧化酶和谷胱甘肽氧化还原状态的变化的文章。
羟基和超氧自由基的检测研究进展
第29卷,第4期 光谱学与光谱分析Vol 129,No 14,pp1093-10992009年4月 Spectro sco py and Spectr al AnalysisA pril,2009羟基和超氧自由基的检测研究进展张 昊,任发政*中国农业大学食品科学与营养工程学院,教育部-北京市功能乳品实验室,北京 100083摘 要 活细胞在必需的新陈代谢过程中会产生自由基,越来越多的研究证据表明,这些自由基涉及到许多体内调控系统,然而一旦有过多的自由基生成便会氧化细胞脂膜、蛋白质、DN A 和酶,进而对细胞造成致命性的损伤。
此外,研究还表明许多疾病与自由基密切相关,例如,有研究报道海氏默症病人脑中生物分子的氧化损伤程度明显高于正常值,另外癌症可能也是DN A 受到氧化损伤的结果。
因此,测定自由基的方法就显得十分必需和重要。
文章重点对羟基和超氧自由基检测技术的发展情况进行了讨论,涉及的自由基检测技术主要有分光光度法、荧光法、化学发光法和电子自旋共振技术,并评价了各种方法的优缺点。
关键词 羟基自由基;超氧自由基;检测技术;评述中图分类号:O 65713 文献标识码:A DOI :1013964/j 1issn 11000-0593(2009)04-1093-07收稿日期:2007-11-28,修订日期:2008-03-06基金项目:国家/十一五0科技支撑项目(2006BAD05A16)资助作者简介:张 昊,1984年生,中国农业大学食品科学与营养工程学院硕士研究生 e -mail:david1hao@sina 1com*通讯联系人 e -mail:r enfaz heng@2631n et引 言羟基自由基(O H #)和超氧自由基(O 2-#)是生物体内活性氧代谢产生的物质,其中O 2-#经一系列反应最终会生成OH #,而OH #是一种氧化性很强的自由基,可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,使糖类、蛋白质、核酸及脂类等发生氧化损伤。
超氧阴离子自由基化学发光探针
超氧阴离子自由基化学发光探针
超氧阴离子（O2^-）是一种高活性的自由基，它在细胞内的产生和清除与多种生理和病理过程密切相关。
因此，开发超氧阴离子的化学发光探针具有重要的科学意义。
超氧阴离子自由基化学发光探针主要通过特定化合物的氧化反应来实现。
这些化合物通过与超氧阴离子反应产生氧化产物，同时伴随着发光现象。
这种发光现象可以通过荧光法或化学发光法来检测。
常用的超氧阴离子化学发光探针包括：氨基甲酸酯（DCFH-DA）、氧化铝（Al2O3）、镁离子（Mg2+）等。
这些探针都有良好的选择性和灵敏度，可以有效地检测超氧阴离子的存在和浓度变化。
超氧阴离子自由基化学发光探针的应用非常广泛，不仅可以在生物学研究中用于检测超氧阴离子的生物产生和代谢过程，还可以在医学诊断中用于检测超氧阴离子在疾病发展中的作用。
此外，超氧阴离子自由基化学发光探针还可以应用于环境监测、食品安全、材料科学等领域。
总而言之，超氧阴离子自由基化学发光探针是一种有效、灵敏和选择性的检测超氧阴离子的工具，对于研究超氧阴离子与生命科学和医学的关系起到重要作用。
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
蒲法章;马淑慧;韦继超;王丹丹;高吉刚;周杰
【期刊名称】《分析科学学报》
【年(卷),期】2009(25)5
【摘要】合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺,利用元素分析、红外光谱等手段对探针试剂进行结构表征;结合邻苯三酚的自氧化作用,建立了一种荧光法测定超氧阴离子自由基（O2^-.）的新方法。
该方法具有操作简单、灵敏度高和选择性好等特点。
邻苯三酚线性范围为4.0×10^-6-1.0×10^-5mol.L^-1。
检出限为2.0×10^-7mol.L^-1。
方法用于大蒜等样品中超氧化物歧化酶（SOD）活性检测,结果满意。
【总页数】4页(P575-578)
【关键词】超氧阴离子自由基(O2-.);香草醛缩苯胺;荧光探针;荧光法
【作者】蒲法章;马淑慧;韦继超;王丹丹;高吉刚;周杰
【作者单位】山东农业大学化学与材料科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】O657.39
【相关文献】
1.香草醛缩苯胺荧光猝灭法测定羟基自由基 [J], 杨青桦;刘士坤;周春燕;顾启帆;高吉刚
2.荧光法测定黄酮类物质对超氧阴离子自由基的清除作用 [J], 李满秀;崔晓霞
3.荧光猝灭法测定痕量镉—四碘合镉罗丹明S—聚乙烯醇荧光猝灭体系的研究 [J], 王钢;何应律
4.羟甲香豆素荧光猝灭法测定羟自由基产生量及常见食品水提物羟自由基清除率测定的研究 [J], 刘颖;冯金朝;周珊珊;王宁波
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利用荧光探针探测细胞中的活性氧物质和自由基研究
利用荧光探针探测细胞中的活性氧物质和自由基研究细胞是生命的基本单位，细胞内的许多代谢程序都和氧相关。
但是，过量的氧会产生一些有害物质，如超氧离子和过氧化氢等，它们被称为活性氧物质和自由基。
过多的活性氧物质会损伤细胞的膜、DNA和酶等结构和功能，因此对于维持细胞正常代谢活动和防止细胞氧化伤害的研究非常重要。
近年来，荧光探针技术的应用越来越广泛。
荧光探针是一种通过荧光检测的手段来测定某种化学过程或生物过程的物质。
荧光探针通过与活性氧物质或自由基特有的反应结合，可以有效地测量细胞内的活性氧物质和自由基的含量和分布，是研究细胞氧化伤害的有力工具。
荧光探针常用的类型有三种，分别是实体荧光分子、荧光素探针和荧光蛋白探针。
实体荧光分子比较简单易得，但使用中有一定的局限性。
荧光素探针识别度较高、对活性氧物质和自由基具有很好的特异性。
荧光蛋白探针则是一种基于生物合成的荧光探针，通过蛋白质的结构和功能的改变来产生荧光信号。
利用荧光探针技术可以测量很多活性氧物质和自由基的含量和分布，常见的有超氧离子、一氧化氮、过氧化氢、硝酸盐和羟基自由基等。
其中，羟基自由基的类别较多，如流式细胞术中常用的DCFH-DA和DHE等。
DCFH-DA是一种非极性化合物。
在细胞内，它会被细胞内酯化酶水解成DCFH，被氧化后生成荧光产物 2',7'-二氯荧光素（DCF），从而测量细胞内活性氧物质的水平。
而DHE则可以通过荧光产物ethidium bromide（EBr）先后加上再用流式细胞仪扫描获得到的荧光后，可以得出有关细胞内自由基的信息。
除此之外，荧光探针还可以排除细胞内其他对荧光信号的干扰，如荧光素P的反应可以被氧气和其他自由基和活性氧消耗掉，从而可以增强测量的准确性。
总之，利用荧光探针探测细胞内的活性氧物质和自由基研究，为我们更好地了解生命活动提供了有效的手段。
在未来的科学研究中，荧光探针技术也将发挥更重要的作用。
dhr123检测超氧阴离子自由基的原理
dhr123检测超氧阴离子自由基的原理以dhr123检测超氧阴离子自由基的原理为标题超氧阴离子自由基是一种常见的氧化性物质，它在生物体内参与多种生理和病理过程。
因此，准确、灵敏地检测超氧阴离子自由基对于研究其生物学效应和相关疾病的发病机制具有重要意义。
dhr123（2',7'-二氯荧光素-二乙酸酯）是一种广泛应用于超氧阴离子自由基检测的荧光探针，其原理如下。
dhr123通过氧化反应而被超氧阴离子自由基还原，从而发生荧光增强。
该原理基于dhr123的化学结构特点，其分子结构中含有一个二氯荧光素基团和一个二乙酸酯基团。
当dhr123与超氧阴离子自由基反应时，超氧阴离子自由基将其还原为dhr123的二氯荧光素基团，使其从非荧光状态变为荧光状态。
因此，通过测量dhr123荧光强度的变化，可以间接反映超氧阴离子自由基的产生与活性。
在实验中，dhr123被用作荧光探针，其使用方法一般分为细胞实验和体外实验两种。
在细胞实验中，首先将dhr123加入细胞培养基中，使其进入细胞内。
超氧阴离子自由基与dhr123反应，产生荧光信号。
然后，通过荧光显微镜或流式细胞术等技术，观察并记录dhr123荧光强度的变化。
荧光强度的增加表示超氧阴离子自由基的生成增加，反之表示减少。
在体外实验中，常用的方法是将dhr123与待测样品一起反应，形成荧光产物。
然后，通过荧光光谱仪等设备测量并记录荧光强度的变化。
荧光强度的变化可以反映出样品中超氧阴离子自由基的含量和活性。
值得注意的是，在进行dhr123检测时，需注意以下几点：1. dhr123的浓度和反应时间需要根据具体实验条件进行优化，以保证荧光信号的稳定和可靠性。
2. dhr123的选择性较高，对其他氧化性物质的响应较弱，但在实验设计和数据解析时仍需注意与其他潜在干扰因素的区分。
3. 超氧阴离子自由基的产生和活性与生理、病理状态密切相关。
因此，在具体实验中，应根据不同的研究目的和条件，选择合适的样本来源和实验方案。
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
2 2 22 22 2 2 2 第 25 卷第 5 期Vo l. 25 No. 5分 析 科 学 学 报JOU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE2009 年 10 月 Oct. 2009文章编号 :100626144 (2009) 0520575204荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究蒲法章 , 马淑慧 , 韦继超 , 王丹丹 , 高吉刚 3 , 周 杰(山东农业大学化学与材料科学学院 ,山东泰安 271018)摘 要 :合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺 ,利用元素分析 、红外光谱等手段对探针试剂进行结构表征 ;结合邻苯三酚的自氧化作用 ,建立了一种荧光法测定超氧阴 离子自由基 (O -·) 的新方法 。
该方法具有操作简单 、灵敏度高和选择性好等特点 。
邻 苯三酚线性范围为 4. 0 ×10 - 6 ～1. 0 ×10 - 5 mol ·L - 1 。
检出限为 2. 0 ×10 - 7 mol ·L - 1 。
方法用于大蒜等样品中超氧化物歧化酶 ( S OD ) 活性检测 ,结果满意。
关键词 :超氧阴离子自由基 (O - ·) ;香草醛缩苯胺 ;荧光探针;荧光法 中图分类号 :O657. 39 文献标识码 :A超氧阴离子自由基 (O - ·) 是一种重要的活性氧粒子 ,它是有氧代谢等生命活动过程不断产生的中间 产物 ,适当量的活性氧自由基粒子的存在有利于维持机体免疫应答 ,而过量的活性氧自由基存在则会对生物机体产生毒害作用 ,生物体的衰老及许多疾病的发生都与活性氧粒子有直接的关系[ 1 ,2 ],由于生物体内活性氧自由基的存在寿命短 ,且稳态浓度非常低 ,测定异常困难 。
因而 ,建立灵敏 、简便的测定方法具有重要的意义 。
多年来 ,人们在 O - ·的测定方面进行了广泛的探索 ,先后有电子自旋共振法 ( ESR ) 、高效液相色谱法 ( H PL C ) 、化学发光法 、分光光度法和荧光法 、电化学方法等报道[ 3 ,4 ]。
羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究
山东农业大学硕士学位论文羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究姓名：马淑慧申请学位级别：硕士专业：应用化学指导教师：高吉刚;周杰20090613山东农业大学硕士学位论文ＣＡＴ共同作用下，变成了无毒的Ｈ２０和０２（ＥｒＴＫｅｔａ１．，２００７）。
其作用机理如下：ＳＯＤ＋０２：———◆ＳＯＤ’＋０２ＳＯＤ‘＋０２：ＳＯＤ＋Ｈ２０２２０２：＋２Ｈ＋竺Ｉ０２＋Ｈ２０２ｎ２０２型－Ｈ２０＋０２ＳＯＤ作为０２·‘的特定指示剂，其活性的测定和０２＂的测定密切相关。
（ＨｅｎｒｙＬＥＡｅｔａ１．，１９７６）由于ＳＯＤ的底物超氧阴离子自由基寿命极短，目前除了应用脉冲射解技术或快速冰冻结合电子自旋共振波谱直接获得ＳＯＤ与超氧阴离子自由基反应的动力学信息外，一般都采用间接的活力测定法来测定ＳＯＤ。
最先用于检测０２·‘的方法有电子顺磁共振波谱分析法及酶学分析法等（ＣｈｅｎｇＳＡｅｔａ１．，２００３）。
这些方法局限性大，灵敏度也不高。
目前文献报道的检测方法主要还有荧光分析法、化学发光法、分光光度法和电化学方法等。
（２）荧光分析法随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要的作用。
相对于其它的方法来说，这种方法具有操作简单、方法灵敏等优点。
Ｔａｎｇ等（ＴａｎｇＢｅｔａ１．，２００４）合成了香草醛．８．氨基喹啉荧光探针试剂，建立了荧光法测定超氧阴离子自由基（０２·‘）的新方法，成功用于一串红植物衰老过程中０２·‘产生速率的测定。
随后他们又合成了用于０２·。
识别的新型荧光探针试剂２．吡啶甲醛苯并噻唑啉。
该探针试剂只能被０２·’氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对０２·’具有专一性。
由此建立了流动注射．荧光法测定０２，的方法（ＴａｎｇＢｅｔａ１．，２００４）。
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二苯 基 异 苯 并 呋 喃 结 合 可 以 作 为 检 测 ０ ・
或 ０ 的荧光指示器 。
２３ ２一（ ． ２一吡啶基 ） 并噻 唑啉 苯
不强， 水溶性与生物兼容性不容易兼有 ， 生物体系的
背景荧光干扰 等。特别是能实现细胞内某一区域的 超氧阴离子 自由基检测的理想 的荧光探针还未见报
倍 ・ Ｈ共存下无 干扰 ， Ｏ 为医学 临床上监测病变组
织内超氧阴离子 自由基提供了新的方法。
２７ 香草醛 缩苯 胺荧 光 探针 ．
红色荧光 ； 其次 Ｈ Ｅ的浓度偏高不仅导致荧光增强 ，
而且能促进超氧阴离子岐化成 Ｈ Ｏ Ｌ 。因此该方 ： ２ 引 法不能准确地定量检测超氧阴离子 自由基。
氧 如图 １ 所示 ， 其产生最早 的为 Ｏ ・ － ￣说它 ，Ｉ ｎ － 是导致 自由基连锁反应 的初始物质 是体内其它 引， 活性 氧 的主要 来源 引。
是三种具有代表性 的活性氧 自由基… ， 这些 自由基 及其活性衍生物 ［ 如脂质 （ Ｈ） 氧化 的产物 （ Ｏ Ｌ 过 Ｌ Ｌ ０・ Ｌ Ｏ ］ Ｏ 及 Ｏ Ｈ） 在体内不断产生， 同时也不断 被生物体的防御体系所 清除， 因此它们被维持在一 个极低的、 有利无害的水平 。但在特殊情况下 ， 如受 到氧化胁迫时， 这些活性 自由基 就能诱 发一系列损 伤机体的反应 ， ］从而导致相关疾病 的产生。许 多 研究表明， 活性氧 自由基在生物体的衰老与疾病 ， 以
ｓ ｎ ｆ ａ ｃ ． ｅ ｐ ｅ ｅ ｔ ｄ ｔ ｅ ｄ ｓｇ ，ｓ ｎ ｅ ｉ ，ａ ｄ ａ ａｙ ｉ ｆ ｔ ｅ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｒ ｂ ｏ ｕ ｅ ｘ ｄ ｉ ｉｃ ｎ ｅ Ｗ ｒ ｓｎｅ ｈ ｅｉ ｇ ｉ ｎ ｙ ｔ ｓｓ ｎ ｎ ｓ ｏ ｈ ｕ ｒ ｓ ｅ ｔ ｐ ｏ ｅ ｆ ｒ ｓ ｐ ｒ ｉ ｅ ｈ ｌ ｓ ｌ ｏ ａ ｉｎ ｒ ｄ ｃ １ ｎｏ ａ ｉａ．
于紫外可见区， 有待更进一步的发展。
３ 展望
证实了磷脂质体与 ｌ３一 ， 二苯基异苯并呋喃产生 的 荧光能被单线态氧猝灭 Ｊ 。因此 ， 磷脂质体与 １３ ，
一
纵 观从 二 十 世 纪 九 十年 代 至今 ， 现 了大量 的 出
荧光探针检测 Ｏ ・ 它们逐渐趋于高选择性 、 ， 高灵
ｏ ｌ ｔｅｒａ ｔ ｅ ｏ ｙ ｅ ｐ ｃｅ ．ｃ ｕｄ ｂ ｒ ｎｌｔｄ ｉｔ ｔ ｅ ｅ ｃｉｅｏ ｙ ｅ ｒｅｒ ｄｃｌ．ｎ ｒｃ ｎ ｆａｌ ｈ ｅ ｃｉ ｘ ｇ ｎ ｓ ｅ ｉｓ ｏ ｌ ｅ ｔ ｓ ｅ ｎｏ ｏｈ ｒｒａ ｔ ｘ ｇ ｎ ｆ ａ ｉａｓ Ｉ ｅ ｅ ｔ ｖ ａ ａ ｖ ｅ ｙ ａｓ ａ ａｇ ｕ ｅ ｆ ｉ ｒｔｒ ｅ ｏ ｅ ｔａ ｓ ｐ ｒｘｄ ａ ｉｎ ａ ｉａ ｉ ｌｓｌ ｒｌｔｄ ｗｉ ｅ ｒ ， ｌｒｅ ｎ ｍｂ ｒ ｏ ｌｅａｕｅ ｒ ｐ ｒ ｄ ｈ ｔ ｕ ｅ ｉｅ ｎｏ ｒｄｃ ｌ ｓ ｏ ｅｙ ｅａｅ ｔ ｔ ｔ ｏ ｃ ｈ
光法相 比较而言更加具有吸引力 ， 不仅简单易行 ， 便 于操作 ， 具有高灵敏度、 高选择性的特 点， 而且可 以
实 现活 细胞 内超氧 阴离 子 自由基 的 “ 原位 可 视化 ” ，
两种新型荧光探针都 能够高选择性 、 高灵敏性地检 测Ｏ ・ 而且具有水溶性好及生物兼容性等优点 。 ，
・
４６ ・
山 东 化 ‘ 工 Ｓ Ａ Ｄ Ｎ Ｈ ＭＩＡ Ｄ Ｓ Ｒ Ｈ Ｎ ０ Ｇ Ｃ Ｅ Ｃ ＬＩ Ｕ Ｔ Ｙ Ｎ
２ １ 年第 ４ ０１ ０卷
（ 氧 自由基 的共轭 酸 ） 超 。另 外超 氧 自由基 在水 溶液 中的存 活时 间约 １， Ｓ在脂 溶 性 介 质 中 的存 活 时 间约 为 ｌ， ｈ 和其它 活 性 氧 自 由基 相 比寿命 较 长 ， 以扩 可 散 到很 远 的距 离 而 达 到 靶 位 置 ， 而 损 害 Ｄ Ａ、 进 Ｎ 蛋
基。近年来大量 文献报 道超氧 阴离 子 自由基与生物体发生的炎症、 衰老及癌症等重大疾病有密切 关系 ， 因此对其 检测 具有非常重 要的科 学意义。本文综述 了有关超 氧阴离子 自由基荧光探针的设 计、 合成及其分析检测 。 关键词 ： 自由基 ； 超氧 阴离子 ； 荧光探针 中图分 类号： ６ １ ０ ５ 文献标识 码 ： Ａ 文章编号 ： ０ ０ １ （０ １ １ — ０ ５ Ｏ １ ８－ ２ Ｘ ２ １ ） ０ ０４ 一 ４ ０
同 ， 同一细胞 内不 同的细胞器 中生物活性物种存 在
在的种类与浓度也不尽相同。比如线粒体是超氧阴
第１ ０期
李晓瑞 ： 超氧阴离子 自由基荧光探针 的研 究进展
定 的局 限性 ， 与超 氧反 应 时 间 长 、 溶性 差 、 如 水 受
到生物体中高浓度 的 Ｇ Ｈ干扰等。因此该探针影 Ｓ
响 了生物样 品中超 氧 阴离子 自由基 的检 测 。 ２５ 双 （ 苯基 次膦 酰基 ） 光素 ． 二 荧 基于超 氧 阴离 子 自由基 的 亲核 性 ，０６年 本课 ２０
第１ Ｏ期
李晓瑞 ： 超氧阴离子 自由基荧光探针的研究进展
・ ５・ ４
超氧阴离子自由基荧光探针的研究进展
李 晓瑞
（ 山东 师 范大 学 化学 化工 与材 料科 学学 院 ， 山东 济 南 ２０ １ ） ５ ０４
摘要 ： 超氧阴离子 自由基 （ ｆ ・） ｏ 是生物体 内重要的 自由基之一 ， 也是所有 活性氧 自由基 的前体 ， 可以转化 为其它的 活性氧 自由
道。
基于超氧阴离子的脱氢反应 ， ０ ２ ４年本课题组 ０
唐波等 设计合成了一种新型荧光探针 ２一（ ２一 吡啶基 ） 苯并噻唑啉 ， 在碱性条件下该探针 能高选
择性地检测超氧阴离子 自由基。 ２４ 二（ ， 二硝基苯磺酸酯基 ） ． ２４一 二氟荧光素
由于细胞 内不 同细胞器 的形态 结构与功能不
图 １ 生物体 内氧 （ ： 代谢过程 ０）
中所产 生的活性氧 自由基
据有关报道 ： 超氧 自由基在水中是一种碱， 它可 以接受一个 Ｈ 形 成质 子化的超氧 自由基 Ｈ ０・ Ｏ
作者简 介 ： 李晓瑞（９２ ）女 ， 鄄城人 ， １８一 ， 山东 硕士 ， 专业 ： 分子探针。
１９ ９ ９年 Ｏ ｙｓｉ 等发现 ： ｈａ ｋ ｈｉ 超氧阴离子能特 异性使磷脂质体与 ｌ３ 二苯基异苯并呋喃产生的 ，一
荧 光减 弱 ， 由此提 出将 １３一二 苯基 异 苯 并 呋 喃 用 ， 于检 测超 氧 阴离 子 。而早 在 １９ ９ １年 Ｗｏｎａ 就 ｚｉ Ｍ ｋ
作简单 、 灵敏度高和选择性好等特点 ， 但是该探针属
Ｎ ｒ ａ Ｕ ｉ ｒｔ，ｎｎ ２０ １ ，Ｃ ｉａ ｏｍ ｌ ｎｖ ｓｙＪ ａ ５０ ４ ｈｎ ） ｅｉ ｉ
Ａｂｔａ ｔＳ ｐ ｒｘ ｅａ ｉ Ｏ ・ ｓ ｌｉ ｏｔ ｔｒｅｒｄｃｌ ｉ ｂｏｏｉ ｌ ｓ ｅ ｓ ｈ ｒｄ ｃｓｏ ｓｒｃ ：ｕ ｅｏｉ ｎｏ ｄ ｎ（ ）ｉ ａ ｒ ｎ ｅ ａｉａ ｉｌ ｃ ｌａ ｅｐｅｅｅｓｒ ｌｍｐ ａ ｆ ｓｎ ｇ ａａ ｗ ｌ ｔ
・
、
及正常的免疫代谢与细胞信号传导等过程 中都起着 举足轻重的作用。因此 ， 关于细胞 内（ 尤其 是生物 信号传导过程 中） 活性 氧 自由基分子 的产生及其作 用机制的研究 日 益备受关注。 在生物体 的新 陈 代 谢 过 程 中 产 生 各种 活性
收稿 日期 ：０ １ ０ ２ ２ １ — ９— ８
２ ２ １３一二苯基 异苯 并 呋喃 ． ，
２０ ０９年高吉刚 。 。 等基于荧光猝灭法设计合成 了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺 ， 建立了一 种荧光法 测定超 氧 阴离子 自由基 （ ・ 的新 方 Ｏ ） 法。有荧光的香草醛缩苯胺被 Ｏ ・ 氧化成醌式结 构， 导致香草醛缩苯胺 的荧光猝灭。该方法具有操
基 于非 氧 化还 原 机理 ，０ ５年 Ｍｅｄ ２０ ａａ等 设 计 合成 了一种 检测 超 氧 阴离子 自由基 的荧 光探针 二
（ ， 二硝基苯磺酸酯基 ） ２４一 二氟荧光素类化合物。
在 模拟 生物 条件 中 ， 探 针 能 高选 择 性 地 检测 超 氧 该 阴离 子 自由基 ， 测 限低 至 １０ｐ ｏ。但 是它 具 有 检 ． ｍ ｌ
ｉ ａ ｍ ｔ ｎ ａｉｇａ ｄｃｎ ｅ ｎ ｔｅ ｊｒｄｓａｅ ，Ｓ ｓｄ ｔ ｔ ｎｉ ｖ ｒ ｉ ｏｔ ｔｏｓｉ ｔ ｃ ｎ ｍ ａ ｏ ， ｇ ｎ ａ ｃｒａｄｏ ｒｍａ ｉ ｓｓ Ｏｉ ｅｅ ｉ ｅｙ ｍｐ ｒ ｃ ｎｉ ｌ ｆ ｉ ｎ ｈ ｏ ｅ ｔ ｃｏ ｓ ｎ ａ ｔ ｅ ｆ ｉ
２６ ２一氯 一１３一二苯 并 噻唑 啉环 己烷荧光探 针 ． ，
从而对它们在生命体 内进行“ 实时在线 ” 观测。
２ 检 测超 氧阴离 子 自 由基 的荧 光探 针 ２ １ 氢 化溴 乙非 啶 ．
基于 Ｐ Ｔ机 理 ， ０ Ｅ ２ ７年本课题 组唐波等 又 ０
设计合成了一种新 型荧光探针 ２ 一氯 一１３一 ， 二苯
曾经一度 ， 氢化溴乙非 啶被广泛用作检测超氧
阴离子 自由基 的荧 光探 针 ¨ 。然 而在 ２０ ０ ４年有
并噻唑啉环 己烷 ， 该探针能高选择性地检测生物体
系内的超氧 阴离子 自由基 ， 并且该探针分子在 ５０ ０
人指出： Ｅ有一定 的局 限性。首 先细胞 内细胞色 Ｈ
素 Ｃ与超 氧阴离 子 自由基 同 处 于线 粒体 中 ， 而且 细 胞色 素 Ｃ 同样 可 以氧 化 氢 化 溴 乙 非 啶 产 生 ６０ ｍ １ｎ
一
白质及磷脂膜等生物分子。近年来研 究表 明 ０ ・ 与人体许多疾病密切相关 ， 如炎症 、 心血管疾病 、 肿
瘤、 衰老等 Ｊ 。因 此 ， 现对 Ｏ ・ 实 的定 量检 测 具 有非 常重要 的科 学意 义 。 目前 ， 于检 测超 氧 阴离子 自由基 的方法 包括 ： 用 电子 顺磁共 振 法 － ，Ｏ 酶 活性 测定 法 ¨ 高 效 液 ９ ＳＤ ］ 引，