土壤酶活性测定

土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008

过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413）

关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社 1986年七月第一版蔗糖酶274-276

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法

（一）方法原理

土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂

1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5g KOH 溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1N NaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：

62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A 液），存于冰箱中；

27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。

将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg 氮的标准液（100ppm）。

（三）测定步骤

（1）标准曲线绘制

吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20 mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定

称取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置24 h。之后用38℃水定容至100ml（甲苯浮在刻度线上）。与此同时，进行以水代替基质（10ml 10%尿素用10ml蒸馏水代替），及无土对照测定。

培养结束后，将悬液过滤。吸取3mL（视情况而定）滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N 的毫克数来表示脲酶活性。

二. 过氧化氢酶测定(容量法)

1. 试剂配制

a. 0.3％过氧化氢溶液：将10ml 30%的过氧化氢用水稀释至1L，此溶液不稳定，需临时配置。

b. 1.5mol/L 硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释至100ml

c. 0.002 N KMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾0.3161g，溶于1升蒸馏水中，贮于棕色瓶中，备用。如果知道酶活性很高的话可以适当变化高锰酸钾浓度

2. 操作步骤

（1）取5g过1mm风干土，置于150mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。

（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。并作无土对照。

（3）将三角瓶放在振荡机上振荡（120r/min）30min后，加入5mL 1.5mol/L硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.002N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点（30s不退色）。

3. 结果计算

以单位土重消耗的0.002moi/l高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差）表示土壤过氧化氢酶活性，其计算式为土壤过氧化氢酶活性（ml KMnO4/g干土）=V/dwt 式中，V为0.002mol/L高锰酸钾毫升数（ml）；dwt为烘干土壤重量（g）。

用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。

（A-B）×T即为过氧化氢酶活性

高锰酸钾溶液标定

吸取2ml0.1N草酸钠标准液于200ml三角瓶中，并加水至80ml左右，投入几粒玻璃珠，再加5ml1:3的硫酸酸化，在电炉上加热2min，取下稍冷，趁热（70-80度）用高锰酸钾溶液滴定，滴至为红色（30s不退色）即达到终点，记下高锰酸钾的毫升数（V）。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算

c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700

式中c（1/5KMnO4）=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；

m——草酸钠之质量，g；

V1——高锰酸钾溶液之用量，mL；

V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；

0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。

土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠法

磷酸酶( phosphatase)能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。

（一）基本原理

土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、α或β-萘磷酸酯和Р-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定是测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用pH 10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用pH 7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用pH 5.0的乙酸盐缓冲液）。

（二）实验试剂

1．酶促反应试剂

1)甲苯。

2)苯磷酸二钠溶液：将 6.75g苯磷酸二钠溶液(C6H5P04Na2·2H20)溶于水，并稀释至1000mL（1mL含25mg酚）。

3)乙酸盐缓冲液(pH 5.0)：称取136g乙酸钠(C2H302Na)溶于700mL去离子水，用乙酸调节至pH5.0，用去离子水稀释至l000mL。

4)柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0)：称取300g柠檬酸钾(C6H507K3)溶于700mL去离子水，用稀盐酸调节至pH7.0，用去离子水稀释至1000mL。

5)硼酸盐缓冲液（pH 9.6与pH 10.0）：称取12.404g硼酸(H3B03)溶于700ml)去离子水，用稀NaOH溶液调节至pH 10.0，用去离子水稀释至1000ml。

2．测定试剂

1) Gibbs试剂：将200mg2，6-双溴苯醌氯酰亚胺(C6H2BrCINO)溶于乙醇，并稀释至100mL。

2)标准溶液：(a)母液：lg酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml_，溶液保存在暗色瓶中；

(b)工作液：10mL溶液(a)稀释至1000mL (lmL含10μg酚)。

（三）操作步骤

1)取10g过1mm筛的风干土样置于l00mL容量瓶中，用1.5mL甲苯处理（泥炭土用5 rnl_甲苯）。

2)处理15rnin后，注入l0mL苯磷酸二钠溶液和l0mL相应的缓冲液（根据磷酸酶的性质确定）。

3)将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养3h后(若不显色或显色不明显，则时间可增至24h)，用38℃的热水将瓶中内容物稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上），再用致密滤纸过滤。

4)对每一土样，设置用10mL水代替苯磷酸二钠基质的对照。并作空白无土对照

5)比色程序：

a取滤液1ml置于100ml_容量瓶中，加5mL相应的缓冲液（根据酶的性质确定），用水稀释至25mL，加1mL Gibbs试剂。