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时间分辨荧光分析法及其应用
目录 膝关节周围滑膜囊的分布
一、时间分辨荧光分析法的基本概念 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 三、时间分辨荧光分析技术简介 四、时间分辨荧光分析法的应用 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用
六、展望
膝关节周围滑膜囊的分布 一、基本概念：
二、时间分辨荧光分析法基本原 膝关节周围滑膜囊的分布 理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标 记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或 生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分 不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、 生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶 细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后, 用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强
膝关节周围滑膜囊的分布
时间分辨荧光免疫原理图
2.优点 膝关节周围滑膜囊的分布
TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素 标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、 稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长， 操作简便和非放射性等特点：
镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激 发光和发射光，从而激发光干扰就可以排 除。 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系
膝关节周围滑膜囊的分布 2.基本技术：
2.1 包被技术 TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素, 因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯 化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外 最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳 酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH 为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。 2.2 标记技术 抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记 物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质 的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数目 和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相 膝关节周围滑膜囊的分布
抗体竞争法。 2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不 同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形 成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全 解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合 剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包 裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激 发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强 弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于 测定蛋白质类大分子化合物。 2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原
膝关节周围滑膜囊的分布
4.在激素方面的应用
用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了 hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测 动物的激素;
TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸 钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分析 促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、 雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时 柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。 现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测
膝关节周围滑膜囊的分布 三、时间分辨荧光分析技术简介
TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双 功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。 基本技术包括包被技术、标记技术、反应 模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中 的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇 (yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有 铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐 (samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,
5.时间分辨荧光分析法（Time resolved
fluoroisnmuno assay,TRFIA） 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技 术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏 度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA） 高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点， 用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长
五、时间分辨荧光分析法在真菌 毒素检测方 膝关节周围滑膜囊的分布 面的应用 1.真菌霉素概述
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、 青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生 的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对 食品、农作物及饲料等污染很严重。
1.2 稀有元素双功能螯合剂 膝关节周围滑膜囊的分布
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗 体结合,因此在标记时需要有一种双功能基 团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或 带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子 连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、 酪氨酸) 连接。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲 液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱, 这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所
膝关节周围滑膜囊的分布 四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应 答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程 中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含 量,对于了解它们ห้องสมุดไป่ตู้理生理作用是十分重要
的。
1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病
膝关节周围滑膜囊的分布 2.在微生物方面的应用
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种
波长的光之外还会发射出波长相同或比吸
收波长更长和的光，这种现象称为光致发
光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后
从激发态的最低振动能级返回到基态时所
发射出的光称为荧光(fluorescence)。
膝关节周围滑膜囊的分布
由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的 理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA 的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗 体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用 标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核
目录 膝关节周围滑膜囊的分布
一、时间分辨荧光分析法的基本概念 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 三、时间分辨荧光分析技术简介 四、时间分辨荧光分析法的应用 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用
六、展望
膝关节周围滑膜囊的分布 一、基本概念：
二、时间分辨荧光分析法基本原 膝关节周围滑膜囊的分布 理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标 记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或 生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分 不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、 生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶 细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后, 用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强
膝关节周围滑膜囊的分布
时间分辨荧光免疫原理图
2.优点 膝关节周围滑膜囊的分布
TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素 标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、 稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长， 操作简便和非放射性等特点：
镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激 发光和发射光，从而激发光干扰就可以排 除。 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系
膝关节周围滑膜囊的分布 2.基本技术：
2.1 包被技术 TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素, 因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯 化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外 最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳 酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH 为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。 2.2 标记技术 抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记 物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质 的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数目 和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相 膝关节周围滑膜囊的分布
抗体竞争法。 2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不 同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形 成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全 解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合 剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包 裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激 发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强 弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于 测定蛋白质类大分子化合物。 2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原
膝关节周围滑膜囊的分布
4.在激素方面的应用
用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了 hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测 动物的激素;
TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸 钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分析 促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、 雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时 柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。 现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测
膝关节周围滑膜囊的分布 三、时间分辨荧光分析技术简介
TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双 功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。 基本技术包括包被技术、标记技术、反应 模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中 的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇 (yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有 铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐 (samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,
5.时间分辨荧光分析法（Time resolved
fluoroisnmuno assay,TRFIA） 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技 术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏 度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA） 高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点， 用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长
五、时间分辨荧光分析法在真菌 毒素检测方 膝关节周围滑膜囊的分布 面的应用 1.真菌霉素概述
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、 青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生 的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对 食品、农作物及饲料等污染很严重。
1.2 稀有元素双功能螯合剂 膝关节周围滑膜囊的分布
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗 体结合,因此在标记时需要有一种双功能基 团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或 带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子 连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、 酪氨酸) 连接。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲 液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱, 这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所
膝关节周围滑膜囊的分布 四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应 答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程 中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含 量,对于了解它们ห้องสมุดไป่ตู้理生理作用是十分重要
的。
1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病
膝关节周围滑膜囊的分布 2.在微生物方面的应用
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种
波长的光之外还会发射出波长相同或比吸
收波长更长和的光，这种现象称为光致发
光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后
从激发态的最低振动能级返回到基态时所
发射出的光称为荧光(fluorescence)。
膝关节周围滑膜囊的分布
由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的 理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA 的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗 体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用 标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核