时间分辨荧光分析法 - 副本
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
(SOP)时间分辨荧光免疫分析实验操作指南
时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项第一节时间分辨反应过程图TRFIA的操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。
下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作.1、样本的采取和保存TRFIA测定的样本一般为血清。
不能使用含抗凝剂EDTA和柠檬酸的样本，因为二者可以螯合铕，使测定值降低。
血清样本可按常规方法采集,溶血和脂血样本可能会影响测值。
样品在2℃-8℃可以保存3-5天，如果需要长期保存，请－20℃保存，避免反复冻融。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。
不要把样本保存在室温，室温放置48小时可能会导致结果不稳定。
2、试剂的准备整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。
从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。
板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。
TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
3、加样在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。
加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。
加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。
加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。
血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。
目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。
产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。
目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β-）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE3抑制素A（inhibin A）等。
产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。
产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。
检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。
由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。
假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。
二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。
1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。
1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。
唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。
它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。
从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。
在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。
对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。
（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序1 开机1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。
1.2 打开计算机显示器。
1.3 启动计算机。
1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。
Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。
在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。
2 开机后准备1.1 清洗液准备1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。
1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。
1.2 样品处理器准备1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。
拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。
1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。
时间分辨荧光免疫层析技术简介
• 测向流层析 • 垂直流层析（渗滤法）
免疫层析技术原理
侧向流层析
• 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） • 流动相：测试液 • 移动：毛细作用 • 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应
图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor）
时间分辨荧光免疫层析技术简介
主要内容
1
免疫层析技术原理
2
免工疫作问标题记机材解决料方介案绍
3
时间分辨荧光分析法
4
应用实例
免疫层析技术原理
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
发展阶段：
• 初期：定性检测 • 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）
• 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的 时间。
• 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、 某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能 回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引 起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。
表1 几种常见的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
四乙基罗丹明 (RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
570～575nm 550nm 490-560nm 354nm
Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
第13讲-第五章-发射光谱技术 激光诱导荧光光谱技术 时间分辨荧光PPT课件
Nf
A21
B12 N
B12 (1 )
B21
N 3 A23 k23
N 2 A31 k31 k32
-
25
Nf
A21
B12 N
B12 (1 )
B21
N3
A23 k23
N 2 A31 k31 k32
结论：荧光光子数与入射光强无关(饱和)。如果B12=B21，
则有
Nf
A21 N 2
dN 2 / dt B12 N1 (B21 k21 A21 k23 A23 )N 2
dN3 / dt (k23 A23 )N2 ( A31 k31 k32 )N3
N1 N2 N3 N
-
20
共振荧光
斯托克斯荧光
图5-4 LIF的三能级模型
-
21
⑴ 共振荧光
假设能级2和3的布居比γ：
-
33
荧光光谱是荧光在发射波长上的强度分布。测量荧
光光谱时，激发光的波长和强度均保持不变，用单色 仪对记录的荧光光谱进行波长扫描，记录在不同波长 上的荧光强度就得荧光光谱。荧光光谱反映了分子在 不同波长上发射荧光的相对强度。
-
34
分子的荧光发射的特征：
-
35
（1）斯托克斯位移
相对吸收光谱，荧光光谱向长波长方向移动(红 移)，称为斯托克斯(Stokes)位移。从能量的观点来 看，斯托克斯位移反映了激发光和发射光之间存在一 定的能量损失。这种能量的流失是激发态的部分能量 通过非辐射弛豫变为分子的振动能。在溶液情况下， 溶剂分子与受激分子之间的碰撞也会引起能量的流失。
-
10
⑷ 碰撞辅助双共振荧光
用两束激光相继地与原子的两 个跃迁发生共振，将原子分两步激 发到较高的能态。但是，双共振荧 光的测量比较复杂，通常只在以下 两种情况时采用：①采用其它的检 测方式会遇到很强的背景辐射或散 射光干扰；②除共振荧光外没有可 用的一步激发方式。
时间分辩荧光分析法1铕荧光检测法标记靶细胞中国试剂网
细胞介导细胞毒作用检测法4：时间分辩荧光分析法1）铕荧光检测法标记靶细胞1．EuCl3的制备：称取58.08mg Eu2O3，用少量1N HCl搅拌至溶解，再用1N NaOH 调节pH至4.0。
加双蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存备用。
2．用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×106/ml，加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖，置冰浴中20分钟，其间摇晃数次。
3．加入30μl 100mmol/L CaCl2溶液终止反应5分钟。
4．用含2mmol/L CaCl2的RPMI-1640培养液洗涤细胞5次。
用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×104/ml。
检测方法1．在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞悬液，每孔加100μl。
2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。
自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl 0.5％Triton X-100。
每个实验置三个复孔。
3．置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养3小时。
4．从每孔吸出20μl上清液，对应加入另一块96孔酶标板中，向第二块板每孔加200μl增强液。
室温中混合5分钟。
在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。
同时做EuCl3的标准曲线：用0.05mol/L pH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度5．特异性杀伤活性计算：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％2）用时间分辩荧光检测法同时检测NK细胞对三种靶细胞的细胞毒性标记靶细胞1．取107靶细胞，用洗涤液（含93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl和2mmol/L MgCl2的50mmol/L pH7.4 Hepes，双蒸水配制）洗涤一次。
小心吸去上清液，用1ml 标记液（洗涤液中加0.5mg/ml磷酸葡聚糖和0.06mmol/L Eu3+或2mmol/L Sm3+或0.2mol/L Tb3+，以及比镧系离子浓度高5倍的DTPA）悬浮细胞。
时间分辨荧光分析技术
1.1 时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。
本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。
1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。
其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。
图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。
1020152530355E N E R G Y ,103c m -16H 5/2G 5/26H 15/27F 0F 2D 05D17F 6F 545D313/249/2Sm 3+Eu 3+Tb 3+Dy 3+H 9/2图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。
当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。
以铕(III)配合物为例，其荧光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。
时间分辨荧光免疫技术
血清HBV-DNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒的数量，病毒的复制情况，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒的状态
HBV-DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确的判断预后和治疗
乙肝疫苗接种的量化评价
二、动态观察疗效和病情检测来自（1）定量分析HBsAg和HBsAb浓度的变化，可以预见急性乙肝是否处于恢复期 如HBsAg浓度降低，HBsAb逐渐升高，说明病情正向恢复期发展反之。反之，HBsAg浓度处于高水平或上升，而HBsAb处于低水平，则容易发展为慢性乙肝或携带者。
（2）定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果。 1、HBeAg向HBeAb转换时期，即表现为HBeAg浓度下降和HBeAb浓度升高。 2、高浓度的HBeAg提示病毒处于高复制状态，有较强传染性。 3、高浓度的HBeAb一方面提示病情的好转，但在有些时候（如肝功能指标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。
HBcAb浓度的高低可以反映病毒感染的状态 乙肝急性感染常为高滴度的HBcAb，恢复期浓度下降，慢性乙肝HBcAb呈持续高浓度。 低浓度的HBcAb一般为恢复期或既往感染。
有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断 非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定 活动性慢性乙肝往往呈进行性变化
三、乙肝疫苗接种 HBsAb是一种真正意义的保护性抗体，其定量的检测可以对其具有的免疫力做出正确的评价，对乙肝的预防起到监督作用。
4
结果准确可靠，价格适中
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原子标记、灵敏度高，有效区分弱阳性与阴性，减少灰区
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两步法采用，最大限度避免HOKE现象出现。（即强阳性的标本检测为阴性）
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五、时间分辨荧光分析法在真菌 毒素检测方 膝关节周围滑膜囊的分布 面的应用 1.真菌霉素概述
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、 青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生 的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对 食品、农作物及饲料等污染很严重。
1.2 稀有元素双功能螯合剂 膝关节周围滑膜囊的布
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗 体结合,因此在标记时需要有一种双功能基 团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或 带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子 连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、 酪氨酸) 连接。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲 液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱, 这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所
二、时间分辨荧光分析法基本原 膝关节周围滑膜囊的分布 理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标 记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或 生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分 不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、 生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶 细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后, 用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强
膝关节周围滑膜囊的分布 四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应 答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程 中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含 量,对于了解它们病理生理作用是十分重要
的。
1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病
膝关节周围滑膜囊的分布 2.在微生物方面的应用
膝关节周围滑膜囊的分布 三、时间分辨荧光分析技术简介
TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双 功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。 基本技术包括包被技术、标记技术、反应 模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中 的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇 (yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有 铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐 (samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,
时间分辨荧光分析法及其应用
目录 膝关节周围滑膜囊的分布
一、时间分辨荧光分析法的基本概念 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 三、时间分辨荧光分析技术简介 四、时间分辨荧光分析法的应用 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用
六、展望
膝关节周围滑膜囊的分布 一、基本概念：
膝关节周围滑膜囊的分布
4.在激素方面的应用
用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了 hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测 动物的激素;
TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬酸 钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分析 促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、 雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时 柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。 现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检测
5.时间分辨荧光分析法（Time resolved
fluoroisnmuno assay,TRFIA） 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技 术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏 度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA） 高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点， 用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长
膝关节周围滑膜囊的分布 2.基本技术：
2.1 包被技术 TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素, 因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯 化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外 最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳 酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH 为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。 2.2 标记技术 抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记 物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质 的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数目 和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基
由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的 理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上； 1982年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA 的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗 体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用 标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种
波长的光之外还会发射出波长相同或比吸
收波长更长和的光，这种现象称为光致发
光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后
从激发态的最低振动能级返回到基态时所
发射出的光称为荧光(fluorescence)。
膝关节周围滑膜囊的分布
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相 膝关节周围滑膜囊的分布
抗体竞争法。 2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不 同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形 成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全 解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合 剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包 裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激 发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强 弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于 测定蛋白质类大分子化合物。 2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原
膝关节周围滑膜囊的分布
时间分辨荧光免疫原理图
2.优点 膝关节周围滑膜囊的分布
TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素 标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、 稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长， 操作简便和非放射性等特点：
镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激 发光和发射光，从而激发光干扰就可以排 除。 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系