鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012
第七组 从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化的实验方案
分子生物学实验设计方案蛋清溶菌酶的分离纯化·············蛋清溶菌酶的分子量鉴定···········组长：喻芳组员：蒙秋萍安贵杰何玉叶刘飞从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化【实验目的】1. 掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原理以及离子交换层析的操作方法2. 理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理3. 掌握电泳原理以及SDS－PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50O C，最适PH为6～7左右。
在280nm 的消光系数[%1cm1A]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本文实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并分离纯化。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离，再用DE-52纤维素离子交换色谱和葡聚糖G50凝胶层析分离纯化，最后用SDS-PAGE鉴定。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012课件
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家 生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
4.1 直接结晶法
优点： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生 产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用 以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
2.2 酶工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及 活性多肽等。
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为⼀个⼩组，同时两个⼩组共同进⾏试验）新鲜鸡蛋打⼊烧杯然后⽤矿泉⽔瓶⼦吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得⼩于8.0），量其体积（量筒50ml），加⼊两倍蛋清体积的（可⽤双蒸⽔替代）去离⼦⽔，边加边缓慢搅拌，拌匀后⽤两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后⽤1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值⾄7.0 左右，再⽤脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离⼦交换树脂的再⽣及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加⼊32 g再⽣的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，⽤去离⼦⽔反复冲洗，以去除杂蛋⽩，滤⼲树脂，⽤等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加⼊等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第⼆天，有⽩⾊沉淀析出，离⼼（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋⽩：4℃条件下，⽤去离⼦⽔透析24 h 左右（1天）直到透析完全（⽤BaCl2与透析液发⽣反应直到没有浑浊产⽣为⽌）。
离⼼去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加⼊1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升⾄8．0～9．0，如有⽩⾊沉淀，即离⼼去除；（碱性蛋⽩在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚⼄⼆醇浓缩：盐析物⽤1 倍去离⼦⽔溶解成稀糊状，装⼊透析袋，在装有聚⼄⼆醇的试管中吸⽔浓缩，收集浓缩液；3·冷冻⼲燥：⽤3 mol ／L 盐酸调pH值⾄5．0，冷冻⼲燥，即得⽩⾊⽚状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：⽤30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏⽔、10％APS 溶液配制⽽成；②溶菌酶的处理：⽤磷酸缓冲液制成50 µg ／mL 的溶液，取10~80 µL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染⾊和脱⾊：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染⾊液中浸泡10～30 min，⽤⽔漂洗⼲净，再⽤脱⾊液脱⾊。
鸡蛋溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡蛋溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质和功能。
3. 培养实验操作技能，提高实验分析能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的碱性蛋白质，主要来源于鸟类的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液等。
溶菌酶具有水解细菌细胞壁的作用，能够有效抑制细菌生长，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的提取原料，通过酶解、离心、透析等步骤提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、NaCl、NaOH、丙酮、硫酸铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、玻璃棒、烧杯、漏斗、滤纸、透析袋等。
四、实验步骤1. 酶解：将新鲜鸡蛋打破，取出蛋清，加入适量的NaCl溶液（浓度为0.5mol/L），搅拌均匀，置于恒温水浴锅中，温度控制在37℃，酶解1小时。
2. 离心分离：将酶解后的溶液以3000r/min的速度离心10分钟，收集上清液。
3. 盐析：在上清液中加入适量的硫酸铵固体，搅拌溶解，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
4. 透析：将沉淀用蒸馏水洗涤，去除杂质，然后将其放入透析袋中，置于蒸馏水中，透析24小时，去除小分子物质。
5. 浓缩：将透析后的溶液在50℃下减压浓缩，使蛋白质浓度提高。
6. 纯化：将浓缩后的溶液加入适量的丙酮，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀在50℃下真空干燥，得到溶菌酶粉末。
五、实验结果与分析1. 酶解过程中，蛋清逐渐变得透明，表明溶菌酶开始释放。
2. 离心分离后，上清液中溶菌酶浓度较高，下清液中含有其他杂质。
3. 盐析过程中，蛋白质沉淀较多，表明溶菌酶在硫酸铵溶液中具有较好的溶解性。
4. 透析过程中，透析袋中的溶液逐渐变得清澈，表明小分子物质已被去除。
5. 浓缩过程中，蛋白质浓度逐渐提高，有利于后续的纯化。
6. 纯化过程中，丙酮沉淀的蛋白质较多，表明溶菌酶在丙酮中具有较好的溶解性。
7. 干燥后，得到白色粉末，表明溶菌酶已被成功提取。
溶菌酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种胞壁质酶，具有破坏细菌细胞壁的能力。
本实验采用鸡蛋清为原料，通过提取、分离和纯化等步骤，制备高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器：- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的生理盐水，搅拌均匀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液，加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取沉淀。
（3）将沉淀用生理盐水溶解，加入适量的G-25凝胶柱，进行凝胶过滤。
（4）收集洗脱液，用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。
3. 溶菌酶纯度鉴定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒，进行电泳分析。
（2）观察电泳图谱，鉴定溶菌酶的纯度。
4. 溶菌酶分子量测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入分子量测定试剂盒，进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）观察电泳图谱，计算溶菌酶的分子量。
5. 溶菌酶活性测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入酶活性测定试剂盒，进行酶活性测定。
（2）记录酶活性值。
6. 溶菌酶蛋白浓度测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入蛋白质浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。
（2）记录蛋白浓度值。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示，溶菌酶的纯度为XX%。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶酶菌的实验报告
一、 溶菌酶的提取纯化
实验日期：2012-10-18
1、 溶菌酶洗脱曲线的制作：
（2）绘制洗脱曲线：
以OD280值为纵坐标，对应中间体积值为横坐标，绘制曲线：
00.25
0.50.7511.25
1.51.7520
3
6
9
12
15
18
21
24
27
二、蛋白含量＆酶活性的测定
实验日期：2012-10-19
根据上表数据，绘制标准曲线：
标准曲线
00.10.20.30.40.50.60.70
10
20
30
40
50
60
OD595
所以直线回归方程：y=0.0101x+0.0573
5
6
（1）从上面数据得出，蛋清的蛋白浓度比提取物的高，但其活性和比活性都比提取物的低。
而且提取物的纯化倍数比较高，为5.44。
（2）酶的活力表示为特定条件下单位时间内转化底物的速度，而细菌悬液的光吸收值的减少速度可以推测酶的活性。
试验过程中，每15 s记录1 次测定管的吸光度值，在15 s 至75 s 之间测定管吸光度值以稳定速度下降，因此对于酶的活性测定，单位时间应选择为15 s 至75 s。
（3）对于这次试验，在操作上我们存在明显的不足，如下：
A．标准曲线上，有两个数据点比较偏离，可能我们测定这两个数据点的OD值时润洗操作未能做到位，导致误差的出现。
B．酶活性的测定上也同样存在一定的误差，例如：平行测3次，但每次的吹打效果不一样，o秒时的OD值不太一致，可能造成不同程度的偏差！。
提取溶菌酶的实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握溶菌酶的提取方法；2. 了解溶菌酶的分离纯化过程；3. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法；4. 学习溶菌酶纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，主要存在于鸡蛋清中。
溶菌酶能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，导致细菌细胞壁破裂，从而起到杀菌作用。
本实验通过提取鸡蛋清中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、考马斯亮蓝G-250、邻苯二甲酸氢钾、苯酚、硫酸铜、氢氧化钠、无水乙醇等；2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平等。
四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取（1）取新鲜鸡蛋清，用4倍体积的0.1mol/L的NaOH溶液溶解；（2）将溶液搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜；（3）次日，将溶液用等体积的4倍体积的0.1mol/L的HCl溶液调节pH至4.5；（4）将溶液置于高速离心机中，以10000r/min离心30分钟；（5）取上清液即为粗提溶菌酶。
2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定（1）取粗提溶菌酶溶液，用硫酸铵饱和溶液进行盐析，调节硫酸铵浓度为0.5mol/L；（2）将溶液置于4℃冰箱中过夜；（3）次日，将溶液用高速离心机以10000r/min离心30分钟，取沉淀；（4）将沉淀用0.1mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲溶液溶解，得纯化溶菌酶溶液；（5）测定酶活力和蛋白浓度，酶活力单位以每分钟产生1μmol的产物为1个单位，蛋白浓度采用考马斯亮蓝G-250法测定。
3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）取纯化溶菌酶溶液，进行SDS-PAGE电泳分析；（2）根据电泳结果，计算溶菌酶的分子量；（3）根据纯化溶菌酶溶液的蛋白浓度和酶活力，计算溶菌酶的纯度。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取通过实验，成功提取了鸡蛋清中的溶菌酶，提取率为0.5%。
蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究
蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究蛋清是一种富含蛋白质的食品，其中含有一种叫做溶菌酶的酶类物质。
溶菌酶具有很强的抗菌作用，可以在食品加工和医药领域中发挥重要的作用。
因此，对蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法的研究具有重要的意义。
一般来说，蛋清中溶菌酶的提取方法可以分为化学法和物理法两种。
化学法主要是利用酸、碱等化学试剂来提取溶菌酶，但这种方法存在一定的毒性和污染性，不太适合在食品加工中使用。
物理法则是利用高压、超声波等物理手段来破坏蛋白质的结构，使溶菌酶释放出来。
这种方法相对来说比较安全，但提取效率较低。
为了提高蛋清中溶菌酶的提取效率，研究人员提出了一种新的方法，即利用离子交换色谱技术来提取溶菌酶。
这种方法利用离子交换树脂将蛋清中的溶菌酶吸附在树脂上，然后通过洗脱的方式将溶菌酶从树脂上释放出来。
这种方法具有提取效率高、操作简单、无毒无害等优点，因此在实际应用中得到了广泛的应用。
除了提取方法的研究外，对蛋清中溶菌酶的定量测定方法也是非常重要的。
目前常用的定量方法有比色法、荧光法、酶联免疫吸附法等。
其中，比色法是一种简单易行的方法，可以通过测定溶菌酶与底物反应后产生的色素来确定溶菌酶的含量。
荧光法则是利用荧光染料与溶菌酶结合后产生的荧光信号来测定溶菌酶的含量。
酶联免疫吸附法则是利用特异性抗体与溶菌酶结合后产生的信号来测定溶菌酶的含量。
这些方法各有优缺点，可以根据实际需要选择合适的方法进行测定。
总之，蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法的研究对于食品加工和医药领域具有重要的意义。
未来，我们可以继续探索新的提取方法和测定方法，以提高溶菌酶的提取效率和测定精度，为人类健康和生活带来更多的福利。
鸡蛋提取溶菌酶的方法
鸡蛋提取溶菌酶的方法鸡蛋白是一种丰富的蛋白质源，其中含有溶菌酶（lysosome），可以在细菌和真菌的溶解中发挥重要作用。
溶菌酶是一种具有溶菌、抗菌活性的酶类。
鸡蛋提取溶菌酶的方法主要包括以下几个步骤：1. 鸡蛋的分离：首先将新鲜的鸡蛋进行分离，只保留蛋清（蛋白质）部分，去除蛋黄。
2. 蛋清处理：将蛋清中的蛋白质与溶菌酶分离，可以采用酸碱沉淀法。
将蛋清加入适量的酸（如醋酸）中，使酸度下降到pH 4以下，随后使用碱（如氢氧化钠）中和酸性溶液，使溶液pH回升到中性左右。
这一过程中，溶菌酶会发生沉淀现象，可以方便地分离出来。
3. 溶菌酶的除杂：蛋清中可能还存在其他酶类或蛋白质，为了获得纯净的溶菌酶，可以进行一轮或多轮的洗涤与纯化。
例如，可以使用盐析法，通过逐渐增加溶液中的盐浓度来沉淀溶菌酶，然后用溶液洗涤沉淀物，最后得到纯净的溶菌酶。
4. 溶菌酶的浓缩与干燥：将纯净的溶菌酶溶液通过浓缩技术（如超滤或冷冻干燥）使溶液浓度增大，得到较为浓缩的溶菌酶溶液。
5. 溶菌酶的活性测定：对提取得到的溶菌酶进行活性测定，可以通过测定其对特定底物的溶解能力来评估溶菌酶的活性。
常见的测量方法包括显色法和滴定法等。
鸡蛋提取溶菌酶的方法相对简单，但有一些需要注意的注意事项：1. 鸡蛋的新鲜度对溶菌酶的提取效果有一定影响，新鲜的鸡蛋中溶菌酶的含量较高。
因此，在进行实验时应选择新鲜的鸡蛋。
2. 溶菌酶的活性与条件相关，如温度、酸碱度等。
在提取过程中需要控制好这些条件，以保证溶菌酶的稳定性和活性。
3. 提取得到的溶菌酶需储存于低温（通常-20C）下，否则易失活。
4. 鸡蛋中的蛋白质含量较高，在提取过程中需要留意对蛋白质的处理，避免产生其他影响或污染。
需要特别注意的是，提取溶菌酶并非只有上述方法，还可以根据实际需要结合其他技术和方法进行提取，例如离心、层析、电泳等。
总结起来，鸡蛋提取溶菌酶的方法包括鸡蛋的分离、蛋清处理、溶菌酶的除杂、溶菌酶的浓缩与干燥以及溶菌酶的活性测定等步骤。
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化
四、实验材料和方法
四、实验材料和方法
1、实验材料：新鲜鸡蛋、磷酸缓冲液（PBS）、乙酸乙酯、正丁醇、蛋白酶 抑制剂、透析袋。
四、实验材料和方法
2、实验设备：高速离心机、真空泵、氮气仪、色谱柱。 3、实验方法： （1）鸡蛋卵清的收集：将新鲜鸡蛋打破，分离出卵黄和卵清， 收集卵清备用。 （2）粗提：将收集的卵清加入磷酸缓冲液（PBS），搅拌均匀 后进行高速离心，取上清液即为粗提液。 （3）沉淀：向粗提液中加入等体积的 乙酸乙酯，充分混合后静置分层，取下层沉淀。 （4）
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与 纯化
目录
01 一、背景介绍
03 三、实验原理
02 二、研究目的 04 四、实验分析
07 参考内容
06 六、结论与展望
一、背景介绍
一、背景介绍
溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的天然抗菌酶，具有抗菌、抗炎、抗病毒 等多种生物活性。近年来，随着人们对食品安全和药物研发的度不断提高，从天 然生物资源中提取和纯化溶菌酶成为了一个热门领域。鸡蛋卵清作为一种丰富的 天然资源，具有较高的溶菌酶含量，因此成为了提取和纯化溶菌酶的重要来源。 本次演示旨在探讨鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化方法，以期为相关领域的研究 提供参考。
四、实验材料和方法
复溶：将沉淀物真空干燥后，加入适量正丁醇溶解，再加入透析袋中透析去 除小分子杂质。 （5）色谱分离：将透析后的溶液通过色谱柱进行分离，收集流 出液，检测其中溶菌酶的纯度和含量。 （6）鉴定：采用光谱分析、分子量测定 等方法对纯化的溶菌酶进行鉴定。
五、实验结果及分析
五、实验结果及分析
二、研究方法与技术
1、材料与设备
1、材料与设备
本研究采用新鲜鸡蛋作为原料，使用离心机、分光光度计、电泳仪等设备进 行实验。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定1 - 副本
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定一、实验目的1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作二、实验原理盐析法1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析“（Salting out）。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法:常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。
SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate）破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。
这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
使蛋白质的电泳迁移率仅仅取决于分子大小这一因素。
当蛋白质的分子量在11，700~165，000之间时，电泳迁移率与分子量对数呈直线关系，符合直线方程式：LgMw= —bx + k式中：Mw为蛋白质分子量，X为电泳迁移率，k和b均为常数。
利用这一关系将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图即可得到一条标准曲线。
只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶作为支持电泳介质。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成。
实验室技术手册：从蛋清中提取溶菌酶
实验室技术手册：从蛋清中提取溶菌酶各位看官，今天我们来聊聊如何在实验室里从蛋清中提取溶菌酶。
溶菌酶是一种能分解细菌细胞壁的酶，广泛应用于医药、食品等领域。
而我们从蛋清中提取溶菌酶，不仅可以研究其性能，还可以应用于实际生产中。
下面，就让我来为大家详细介绍这个实验的步骤吧。
第一步，将新鲜鸡蛋打入离心管中，加入适量柠檬酸钠溶液，用移液器反复吹打，使蛋清和蛋黄充分混合。
这一步是为了确保蛋清和蛋黄均匀混合，提高提取效率。
第二步，将混合液转移到另一个离心管中，加入适量磷酸缓冲液，再次用移液器吹打，使溶液充分混合。
这一步是为了提供一个适宜的pH环境，有利于溶菌酶的提取。
第三步，将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心10分钟。
这一步是为了将混合液中的固体物质沉淀下来，得到较纯净的蛋清水溶液。
第四步，取离心后的上清液，加入等体积的乙醚，用移液器反复吹打，使溶液充分混合。
这一步是为了去除蛋清水溶液中的脂溶性物质，提高溶菌酶的提取纯度。
第五步，将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心5分钟。
这一步是为了将混合液中的乙醚和脂溶性物质沉淀下来，得到较纯净的蛋清水溶液。
第六步，取离心后的上清液，用移液器移入干净的试管中，放入冰箱冷藏保存。
这一步是为了保存提取得到的溶菌酶，避免其降解。
总的来说，从蛋清中提取溶菌酶的实验步骤如下：1.将新鲜鸡蛋打入离心管中，加入适量柠檬酸钠溶液，用移液器反复吹打，使蛋清和蛋黄充分混合。
2.将混合液转移到另一个离心管中，加入适量磷酸缓冲液，再次用移液器吹打，使溶液充分混合。
3.将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心10分钟。
4.取离心后的上清液，加入等体积的乙醚，用移液器反复吹打，使溶液充分混合。
5.将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心5分钟。
6.取离心后的上清液，用移液器移入干净的试管中，放入冰箱冷藏保存。
这样，我们就成功从蛋清中提取出了溶菌酶。
鸡蛋清的溶菌酶的提取工艺流程注意事项
鸡蛋清的溶菌酶的提取工艺流程注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!鸡蛋清中的溶菌酶是一种具有抗菌活性的蛋白质，广泛应用于医药、生物工程等领域。
蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究
蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究一、引言蛋清是一种富含溶菌酶的天然源，溶菌酶具有广泛的应用价值，在医药、食品、环境等领域发挥着重要作用。
因此，高效提取蛋清中的溶菌酶，并开发可靠的定量测定方法具有重要意义。
二、蛋清中溶菌酶的提取方法研究进展2.1 传统提取方法1.直接破碎法–原理：将鸡蛋或鸭蛋直接破碎，通过离心等方法分离溶菌酶。
–优点：简单、快速。
–缺点：溶菌酶的提取率和纯度较低。
2.盐析法–原理：通过加入适量的盐类使溶菌酶沉淀，然后进行后续纯化。
–优点：提取率较高。
–缺点：纯化过程繁琐，提取时间较长。
2.2 新型提取方法1.超声提取法–原理：利用超声波作用下产生的微小气泡破坏细胞结构，释放溶菌酶。
–优点：提取效率高，提取时间短。
–缺点：对溶菌酶活性有一定影响。
2.酶解法–原理：使用特定酶解剂使蛋清中的蛋白质部分降解，释放溶菌酶。
–优点：提取效率高，对溶菌酶活性影响较小。
–缺点：酶解过程需要精确控制条件。
三、蛋清中溶菌酶的定量测定方法3.1 比色法1.基于物质的变化–原理：溶菌酶对某种物质具有催化作用，该物质的变化可以被检测器测定。
–优点：操作简单，成本较低。
–缺点：适用范围有限。
2.酶联免疫吸附法–原理：利用特异性抗体与溶菌酶结合，通过测定抗体与酶的结合程度来定量溶菌酶。
–优点：高灵敏度，高特异性。
–缺点：实验操作复杂。
3.2 光学测定法1.比色法–原理：溶菌酶具有特定的吸收光谱，在特定波长下可以测定其浓度。
–优点：操作简单，结果准确。
–缺点：需要专用仪器。
2.荧光法–原理：利用溶菌酶在特定条件下的荧光特性来定量测定其浓度。
–优点：高灵敏度，高选择性。
–缺点：试剂成本较高。
四、结论通过对蛋清中溶菌酶的高效提取方法和定量测定方法的研究，我们可以得出以下结论： 1. 新型提取方法如超声提取法和酶解法可以提高溶菌酶的提取率和提取效率。
2. 定量测定方法如酶联免疫吸附法和荧光法具有高灵敏度和高特异性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
X 是将1L饱和度为 C1 溶液提高到饱和度为 C2 时，需要加入固体硫酸铵的 重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。
现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成 表，使用时不需计算可直接从表中查出。
医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐 方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有较好应 用价值。
2.1 食品工业上的应用 选择性的分解微生物的细胞壁，而不能作用于其 它物质，主要应用于海产品、水产品、乳制品和 干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及 水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜。 加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中, 也可起到防 蛀牙、爽口的作用。 为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶， 制成母乳化奶粉，可以加强婴幼儿的抗感染能力， 可以促进婴儿胃内乳酪蛋白形成细微凝乳，有利 于婴儿的消化吸收。特别对早产婴儿，有防止体 重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。
2.2 酶工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及 活性多肽等。
2.3 发酵工业上的应用 溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率， 还可以大大缩短酵母膏的制备时间。 溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。
2.4 医学上的应用 溶菌酶制备的口腔药片或漱口液 治疗副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳 炎等疾病。 作口服剂可抑制流行性感冒和腺病毒的生长、抗感 染及抗炎症，还具有多种药理作用。 还具有一定的保健作用；有促进血液凝固和止血作 用；有组织再生和瘢痕形成促进作用等。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工鲜蛋总产量的 40%。 1kg鸡蛋大约8元，提取出溶菌酶，可以得到3.5g， 溶菌酶纯品售价60 元/1g左右。因此，进行溶菌酶的 提取工艺研究，有着重大的科学意义和现实意义。
4 溶菌酶的提取工艺
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法: 常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。
SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate）
破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共 价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别 是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白 质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这 就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷 的SDS-蛋白质复合物。
5 溶菌酶活力的测定方法
典型作用底物是细胞壁粘多糖、甲壳素及糖苷。
溶菌酶的测定方法有两大类： （1）利用酶反应测定酶活性： 用对溶菌酶敏感的革兰氏阴性菌（主要是溶壁微球 菌）、甲壳素及其衍生物、人工合成的寡聚糖作为底 物。本类方法简便、灵敏，但影响溶菌酶活性的因素 很多，稳定性差。
比浊法 琼脂平板法 比色法 荧光强度及荧光偏振法
4.5 反胶团萃取法
反胶团的主要应用是萃取蛋白质。目前研究使用最多的是阴离子表面活性 剂 AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，简称 AOT)。该表面活性剂价 廉易得，分子极性头小，有双链，形成反胶团时不必加入助表面活性剂， 形成的反胶团极性核大，有利于蛋白质分子的进入。 AOT/异辛烷/水体系是最常用的反胶团萃取体系，对于分离溶菌酶这类相 对较小的分子来说，具有较好的分离效果。但是对于分子量大于 30000的 蛋白质则不易分离。 1998 年，反胶团萃取法从蛋清中直接分离溶菌酶。在离心管中将蛋清稀释 液与等体积的有机相（AOT/异辛烷）混合，恒温水浴，高速摇动，混合50 分钟后，在 3000rpm 下离心 5 分钟。分离得上层即反胶团萃取液，加入等 体积的 pH11.8 磷酸盐缓冲液，震荡 45 分钟，进行反萃取。离心后，收集 下层水溶液，分析溶菌酶浓度，测定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收 率达 90%，活性达73000u/mg，比大多数商业产品活性高。
2.5 科学研究中的应用 利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生 物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从 而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领 域。
3 溶菌酶的生产现状及前景
上世纪50年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。 采用从鸡蛋清中直接结晶得溶菌酶，产品用来制作 口服药剂。 上世纪60年代，又开发了离子交换法，进一步降低 了生产成本，提高了产品质量，达到了注射级药品 质量要求。 上世纪70年代，开发了亲和色谱技术，主要用于高 纯度生化试剂的生产。 近来超滤法与其它方法相结合，进一步提高了溶菌 酶的生产工艺水平。
鸡蛋清溶菌酶的提取及电 泳鉴定
药学院 2010-12-19
实验目的：
1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理
2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作
3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作
1 溶菌酶的性质
溶菌酶 (Lysozyme, EC 3.2.1.17) 由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家 生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
4.4 超滤法
超滤法的早期应用主要是对溶菌酶的浓缩精制。它利用膜两侧的压力差， 使水分、盐类及糖类等小分子透过膜，而溶菌酶等蛋白质大分子物质留在 膜内不能透过，从而达到浓缩效果。它的优点是无相变、操作简单、操作 费用低、产品不易失活。 溶菌酶的分子量仅 14300，而蛋清中其它蛋白质的分子量则在 30000 以上， 因此可选择适当的分离膜，以超滤法滤出溶菌酶。而残留的大量蛋清则可 直接应用于食品加工。
不规则的椭圆体，比较容易结晶，结晶形状随结晶 条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结 晶等。用X射线衍射测得此酶的体积为45×30×30Ǻ。
性质非常稳定：当 pH 值在1.2-11.3 范围内剧烈变化 时，其结构几乎不变。 遇热也很稳定，pH 值 4-7、100℃处理1分钟仍保持 原酶活性；pH值 5.5、50℃加热 4 小时后，酶活不受 影响。但是，在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较 差，易变性。 热变性随着有机溶剂的增加而直线下降。
水分
蛋白质
碳水化合物 维生素和色素 灰分 脂质 酶
4.1 直接结晶法
优点： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生 产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用 以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。
Hammarster用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋 白、球蛋白两部分。 硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等盐析蛋白质， 其中运用最广的是硫酸铵。
硫酸铵优点: 化学性质稳定； 溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度； 溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度 变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L，即 767g/，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L; 价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
溶菌酶对变性剂相对不敏感。在 6M 盐酸胍溶液中， 酶完全变性，但在8M尿素中则不变性。 吡啶、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，氧化剂 能使酶钝化。
2 溶菌酶的应用
水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间β-1，4糖苷， 破坏革兰氏阳性细菌细胞壁而具有溶菌作用，是一 种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁 溶解酶（Muramidase）。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。 免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。 许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍 加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶” （Salting in）。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得 不深而自动析出，这种现象称为“盐析“（Salting out）。
鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是 目前了解最清楚的溶菌酶之一。 白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破 坏，不溶于丙酮、乙醚中。
其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链， 有四对二硫键，分子量为14300。
碱性球蛋白，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色 氨酸残基的比例很高。其等电点为 pH10.7；其最适 pH 值为 pH7 左右，最适温度为50℃。
广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、 唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液中及白细胞和组织 （如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含 有此酶。 人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活 力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶 是从蛋清中提取的。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。