末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展_李红

末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展李 红(安庆市卫生学校,安徽安庆 246011)摘 要:末端限制性酶切片段长度多态性分析(T erminal Restriction Frag ment Leng thPolymorphism,T -RFLP)是近年来发展起来的、不依赖于培养的微生物群落分析方法之一.由于其在微生物群落结构分析方面的特点,包括分辨率高、易于实现自动化及互联网海量数据共享等优势,自1997年最先被报道以来得到了广泛的应用,成为环境微生物群落分析的最强有力的工具之一.类似于其他的分子微生物生态学技术,T -RFLP 也有自身的缺陷,本文详细介绍了T -RFLP技术的原理及其解析环境微生物群落的基本流程,简述了近年来T -RFLP 技术在群落分析中的研究进展,重点讨论了该技术的局限性及相应的解决办法.关键词:微生物群落;末端限制性片段长度多态性分析;分子微生物生态学;生物多样性中图分类号:O657.1 文献标识码:A 文章编号:1001-2443(2006)06-0582-04引 言环境中的微生物都不是单独存在的,总是通过各种作用形成微生物群落.分析微生物的群落结构,了解其与环境相互作用关系,有助于从种群和群落水平上深入理解环境中的微生物;了解环境污染物迁移转化的微生物学基础;更深刻地认识各种生物处理工艺的微观机理,从而为调控和优化微生物群落、提高处理效果提供理论指导.传统的微生物群落分析方法建立在微生物纯种培养分离的基础上.而环境中微生物群落结构非常复杂、多样性极高,因此传统方法存在致命缺陷:无法培养自然界中所有微生物[1],也无法反映自然条件下微生物群落的真实情况[2].所以,有必要研究不依赖微生物培养的环境微生物群落分析方法.1986年Pace 等人利用核酸序列分析技术研究微生物的生态和进化以来,分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落分析,研究方法也层出不穷,包括荧光原位杂交法(Fluorescence In Situ Hybridization ,FISH )[3]、限制性酶切片段长度多态性分析法(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)[4]、变性梯度凝胶电泳法(DenaturingGradient Gel Electrophoresis,DGGE)[5]等. 末端限制性酶切片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T -RFLP)是RFLP 基础上发展起来的新技术,相对于其它分子生物学技术具有分辨率高、易于实现自动化等特点,是分析复杂环境微生物群落的强有力的工具之一[6,7].1 T-RFLP 技术的基本原理T -RFLP 技术以分子系统学原理为基础,综合运用了PCR 、限制性酶切、荧光标记和DNA 序列分析等技术,通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构和功能.首先根据比较基因组学原理选取一段具有系统进化标记特征的DNA 序列作为目标分析序列.从原理上讲,微生物群落中任何具有特异性的DNA 片段都可以作为目标分析序列,包括微生物核糖体小亚基(SSU)16S rRNA(原核生物)和18S rRNA (真核生物)的基因序列[8],以及一些保守的功能基因序列等.之后根据目标基因序列的保守区设计引物,荧光标记.提取总DNA,PCR 扩增片段一端带有荧光标记.限制性内切酶对扩增的DNA 消化,产生长度不同的片段.电泳分离、荧光检测,检测带荧光标记的片段(Terminal Restriction Fragment,T -RF).通过分析,揭收稿日期:2006-03-16作者简介:李红(1966-),女,安徽安庆人,讲师,硕士.第29卷6期2006年12月 安徽师范大学学报(自然科学版)Journal of Anhui Normal University (Natural Science)Vol.29No.6Dec .2006示样品种类、数量和种群大小等信息,从而解析群落结构、功能及动态变化.2 T-RFLP技术分析微生物群落的步骤2.1 环境样品的采集、预处理和群落总DNA的提取T-RFLP分析的微生物群落可以来自土壤[9,10]、水体[11]、河流底泥[3]或各种人工生物处理工艺的任一部分水体或污泥[12,13].不同的采样和预处理会对DNA提取、扩增和分析产生重大影响[14,15].环境样品总DNA的提取是T-RFLP的关键技术之一.DNA提取法应尽可能地提取样品中所有微生物的完整的DNA分子,使之能够代表样品中的遗传多样性的实际情况.关于群落总DNA的提取方法已经有很多研究和报道,不同方法具有各自的背景和特点[16,17].由于实际操作中很难保证对所有微生物的完整DNA分子进行提取,所以必须根据T-RFLP分析的目的来选取DNA提取方法.2.2 引物设计与PCR扩增要根据所研究的微生物菌群的具体情况设计引物.对于细菌或古菌,根据其16S rDNA上的某些保守区域来设计通用型引物.对于真核微生物,相应的分类进化分子标记是18S rDNA.另外,根据编码一些蛋白质氨基酸残基的DNA序列具有高度保守特异性,也可以设计PCR的引物.具体操作上,对于复杂的微生物群落,选择不同引物扩增得到的目标序列的回收率可能会有差异[15],为了尽可能降低因引物效率和特异性差异带来的影响,在引物设计时使用计算机进行分析[18].PCR扩增反应是整个分析的关键步骤之一.不同PCR反应适用不同情况.影响PCR扩增反应的因素也很多,包括模板DNA的浓度、退火温度、反应循环次数、PCR反应体系的组成,Taq酶的种类和浓度、PCR反应程序的设定等等[15-19],要通过各种优化来确定最适宜的反应体系和反应条件.2.3 扩增产物的限制性酶切对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,除去残留的带荧光标记的引物,以防止它们对后续分析和检测造成干扰.通常选用识别4个碱基识别位点的合适浓度的内切酶加到一定量纯化后的PCR扩增产物中,在该酶最适的反应体系和温度下进行限制性酶切反应.另外,不同核酸限制性内切酶种类对T-RFLP图谱会产生显著的影响.研究表明,分析细菌16S rDNA 多态性时,H haI,RsaI,以及BstU I这3种限制性内切酶最为有效,可产生数量最多的末端限制性片段[20].引物不同,同一种酶切后T-RFs变化较大;引物一定,选择不同的内切酶,产生的T-RFs数目也有显著的差别.值得指出是,不同限制性内切酶可以引入程度不同的 假带 (Pseudo-T-RFs).所以,不应简单地认为能够产生数量最多的末端限制性片段的酶就是最优的[21].2.4 电泳分离与检测酶切后的DNA片段与标准物混合后,利用DNA测序仪进行电泳分离、并进行荧光强度检测.带有荧光标记的片段被测出,无荧光标记的片段则不出现在T-RFLP图谱中,这个过程被称为 基因扫描(Gene Scan) .根据各个T-RF的电泳时间与标准DNA参照物比较计算T-RF片段大小.2.5 T-RFLP图谱的解析图谱分析时,首先要确定DNA片段长度处于一个合适范围[22,23],并且荧光强度超过一定阈值的峰才被纳入数据处理.提高阈值,可减少平行样品图谱中的不可重复峰,但也会使一些可重复峰消失,造成对多样性的低估[7].Dunbar等[7]建议尽可能降低检测阈值,通过平行实验,将图谱中重复再现的峰纳入分析.带有荧光标记的T-RF被DNA测序仪中的荧光检测器检测出来,反映为图谱中的各个 峰 .峰对应的横坐标代表T-RF的片段长度;纵坐标代表含有荧光物质T-RF的荧光强度;峰面积代表具有相同片段长度所有T-RF的荧光强度的总和.那么T-RFLP图谱中包含以下信息:物种丰度(Richness):S=图谱中显著峰的总数,这里粗略认为每个峰对应着一个不同的物种.多样性指数:描述群落多样性的指数有很多,比如通过以上T-RFLP图谱,可以计算Shannon-Weiner指数:H=- p i ln p i或Simpson指数:D=1- p i2其中:p i表示某个峰的峰高占总峰高的比例.物种均度(Evenness):E=HH max 其中:H max=ln S58329卷第6期 李 红: 末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展584安徽师范大学学报(自然科学版)2006年对于实验得到的多个群落的T-RFLP图谱,可以分别计算上面的这些指标,进行群落间的比较分析,也可以构造每个群落在一定意义下的距离矩阵,通过计算群落相似度对不同群落图谱进行定量比较[24].环境微生物群落通常都非常复杂,具有很高的多样性,表现在T-RFLP图谱上就是具有数量相当多的显著峰,因此,T-RFLP图谱的准确分析要利用一些统计学或生物数学中的专门算法[25,26].为了解每个T-RF所代表的物种,还需要分析T-RF对应的DNA片段的序列.3 T-RFLP分析微生物群落的局限性及其解决方法T-RFLP的局限性:1)摆脱不了PCR技术共同的缺陷,如不同菌种DNA的差异性扩增,以及目标DNA在菌种间拷贝数的差异等等[27,28];2)T-RFLP图谱中每个T-RF有可能不只对应一个菌种,造成对群落多样性的低估;3)酶切后T-RF的长度分布也会造成对复杂群落多样性的低估.因为测序仪检测500bp以上的T-RF精度不够[29];4)实验过程影响因素众多,使得T-RFLP图谱的解析存在一定的不确定性;5)在如何对大量T-RFLP数据进行处理和统计学分析,以挖掘出其中的群落结构信息方面,很多理论和技术上的问题仍处于摸索阶段.为解决上述局限性,需要根据研究目的、样品、环境条件等对T-RFLP分析的各个步骤进行优化,如:对DNA片段进行克隆、测序和分析;利用多种酶对PCR扩增产物分别进行酶切,将多个T-RFLP图谱进行综合分析;利用毛细管电泳技术,提高分辨率[29]等等.总之,尽管T-RFLP技术存在不少的缺陷,但是,在复杂微生物群落研究中,该技术仍然具有其它许多分子生物学技术所不具备的优越性.更高的分辨率使之更适合于对微生物群落多样性进行灵敏的分析评价,以及快速地研究、分析微生物群落的变化规律.参考文献:[1] AM ANN R I,LUDW IG W,SCHLEIFER K H.Phylogeneti c identification and i n situ detection of indi vidual microbial cells w ithout culti vation[J].M icrobiological Reviews,1995,59(1):143-169.[2] ROSS ELL -M ORA R,AM ANN R.The species concept for prokaryotes[J].FEM S M icrobiology Review s,2001,25(1):39-67.[3] LLOBET-BROS SA E,ROSS ELL -M ORA R,AM ANN R.M icrobial community composition of W adden Sea sediments as revealed byfluorescen ce i n situ hybridi zation[J].Applied and Envi ronmental M icrobiology,1998,64(7):2691-2696.[4] ACINAS S G,RODR GUEZ-VLERA F,PEDR S-ALI C.S pati al and temporal variation in marine bacteriopl ankton diversity as shown byRFL P fingerprinti ng of PCR am plified16S rDNA[J].FEM S M icrobiol ogy Ecology,1997,24(1):27-40.[5] R LLEKE S,GURTNER C,DREW ELLO U,et al.Anal ysis of bacterial communities on h i storical glass by denaturing gradi ent gelelectrophoresis of PCR-am plified gene fragments coding for16S rRNA[J].Journal of M icrobiological M ethods,1999,36(1-2):107-114. [6] LJKOW T,DUNFIELD P F,LIESACK e of the T-RFLP techn i que to assess spatial and temporal changes in the bacterial communitystructure within an agricultural soil planted w ith transgen i c and non-transgenic potato plants[J].FEM S M i crobiology Ecol ogy,2000,32(3):241 -247.[7] DU NBAR J,TICKNOR L O,KUSKE C R.Phylogen etic specifici ty and reproducibili ty and new method for analysis of terminal restrictionfragment profiles of16S rRNA genes from bacterial communi ties[J].Applied and Environmental M icrobi ology,2001,67(1):190-197.[8] 沈萍.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:314-320.[9] VRE S L,T ORSVIK V.M icrobial diversi ty and community structure in tw o different agricultural soil communi ties[J].M icrobial Ecology,1998,36(3):303-315.[10] DUNBAR J,T AKALA S,BARNS S M,et al.Levels of bacterial community diversity in four arid soils compared by cultivation and16S rRNAgen e cl oning[J].Applied and Environmental M icrobiology,1999,65(4):1662-1669.[11] SCALA D J,KERKHOF L J.Horizontal heterogeneity of denitrifying bacterial communities in marine sediments by terminal restrictionfragment length polymorphism analysis[J].Applied and Environmental M icrobiol ogy,2000,66(5):1980-1986.[12] E ICHNER C A,ERB R W,T IM M IS K N,et al.Thermal gradient gel electrophoresis analysis of bioprotection from pollutant shocks in theactivated sludge microbial community[J].Applied and Environmental M icrobiology,1999,65(1):102-107.[13] ESCHENHAGENA M,SCHU PPLERB M,R SKE I.M olecular characterization of the microbial community structure in tw o activated sludgesystems for the advanced treatm ent of domes tic effluents[J].Water Research,2003,37(13):3224-3232.[14] GORDON D A,GIOVANNONI S J.Detection of stratified microbial populations related to chlorobium and fibrobacter species in the Atlanticand Pacific Oceans[J].Applied and Environmental M i crobiol ogy,1996,62(4):1171-1177.[15] WINTZINGERODE F V,G BEL U B,STACKEBRANDT E.Determination of microbial diversi ty in environm ental samples:pitfalls of PCR-based rRNA analysis [J].FEM S M icrobiology Review s,1997,21(3):213-229.[16] KRSKE M ,WELL INGTON E M parison of different methods for the isolati on and purification of total community DNA from s oil [J].Journal of M icrobiological M ethods,1999,39(1):1-16.[17] LEFF L G,DANA J R,M cArthur J V,et pari son of methods of DNA extraction from stream sediments [J].Applied andEnvironmental M icrobiology,1995,61(3):1141-1143.[18] BRUNK C F,AVANISS -AGHAJANI E,BRUNK C A.A Computer analysis of primer and probe hybridization potential with bacterial small-subunit rRNA sequences [J].Applied and Environm ental M icrobiology,1996,62(3):872-879.[19] OSBORN A M ,M OORE E R B,TIM M IS K N.An evaluation of termina-l restricti on fragment length polymorph i sm (T -RFLP)analysis forthe study of microbial community structure an d dynamics [J].Environmental M icrobiology,2000,2(1):39-50.[20] BRAKER G,AYALA -de-l R o H L,DEVOL A H ,et munity structure of denitrifiers,bacteri a,and archaea along redox gradients inPaci fic northw est marine sediments by terminal res triction fragment length polymorphism analysis of ampli fied ni trite reductase (nirS)and 16S rRNA gen es [J].Applied and Environmental M i crobiol ogy,2001,67(4):1893-1901.[21] EGERT M ,FRIEDRICH M W.Formation of pseudo -terminal restriction fragments,a PCR -related bias affecting term i nal restriction fragmentlength polymorphism analysis of microbial community structure [J].Applied and Environm ental M icrobiology,2003,69(5):2555-2562.[22] EDEL -HERM ANN V,DREU M ONT C,P rez-Piqueres A,et al.T erminal restriction fragment length polymorphism analysis of ribosomalRNA genes to as sess changes in fungal communi ty structure in soils [J].FEM S M icrobi ology Ecology,2004,47(3):397-404.[23] M OESENEDER M M ,ARRIETA J M ,M UYZER G,et al.Optimization of termina-l restriction fragment length polymorphism analysis forcomplex marine bacterioplankton communities and comparison w i th denaturi ng gradient gel electrophoresis [J].Applied and Environmental M icrobiology,1999,65(8):3518-3525.[24] DUNBER J,TICKNOR L O,KUSKE C R.Assessment of microbial diversity in four southw estern United States soils by 16S rRNA geneterminal restri ction fragment analysis [J].Applied and Environm ental M icrobiology,2000,66(7):2943-2950.[25] BLACKWOOD C B,MARSH T L,KIM S H,et al.Terminal res triction fragment length polymorphism data anal ysis for quantitativecomparison of microbial communities [J].Applied and Environm ental M icrobiology,2003,69(2):926-932.[26] DOLLHOPF S L,HASHSHAM S A,TIEDJE J M.Interpreting 16S rDNA T -RFLP data:application of sel-f organizing maps and princi palcomponent analysis to describe community dynamics and convergence [J].M icrobi al Ecology,2001,42(4):495-505.[27] HENCKEL T ,FRIEDRICH M ,CONRAD R.M olecular analyses of the methan e -oxidizing microbi al community in rice field soil by targetingthe genes of the 16S rRNA,particulate methane monooxygenase,and mithanol dehydrogenase [J].Applied and Environmental M icrobiology,1999,65(5):1980-1990.[28] M OESENEDER M M ,W INT ER C,ARRIETA J M ,et al.Termina-l restricti on fragment length polymorphis m (T -RFLP)screening of amarine archaeal clone li brary to determine the different phyl otypes [J].Journal of M icrobiological M ethods,2001,44(2):159-172.[29] WATT S J E M ,WU Q,SCHREIER S B,et parative analysis of polychlori nated biphenyldechlorinating communi ties in en richmentcultures using three different molecular screening techniques [J].Environmental M icrobiology,2001,3(11):710-719.Progress of T -RFLP Analysis for Microbial CommunityLI H ong(Anqing H ealth S chool,Anqing 246011,Ch i na)Abstract:Term inal Restriction Fragment Length Polymorphism (T -RFLP)analysis is a culturing -independent approach for env ironmental microbial comm unity analysis.It is proved pow erful and w idely applied since developed in 1997for its high resolution and g reat databases.The limitations of and strategy for improving the T -RFLP approach are discussed in this paper as w ell as the principle and the general procedure for microbial community analysis.Besides,a brief review is also made on the research of environmental microbial community w ith the T -RFLP approach.Key words:microbial com munity analysis;T -RFLP;molecular microbial ecology;microbial diversity 58529卷第6期 李 红: 末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展。