流式细胞仪技术
流式细胞仪技术
①细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。
②肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。
近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。
用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。
③免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。
④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。
⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。
细胞凋亡研究细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。
细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。
1. 细胞形态变化：通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。
在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，90°角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信号均降低。
此方法特异性不强，目前使用较少。
2 细胞膜功能改变：（1）磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术（Flow cytometry）是一种用于检测和分析细胞的高通
量技术，能够同时分析多种细胞参数。
其原理是通过将单个细胞悬浮液通
过一个细长管道，然后通过激光束照射细胞并记录细胞与激光的相互作用，最后用多个光学信号检测器来收集和分析这些信息。
细胞排序是流式细胞技术的第二步。
流式细胞仪可以根据不同的细胞
参数，如大小、形状和荧光强度等对细胞进行排序。
这种方法可以根据用
户的需求，选择性地分离和收集一些细胞亚群，进一步进行下一步的实验
分析。
数据分析是流式细胞技术的最后一步。
流式细胞仪会收集大量的数据，包括荧光信号的亮度和位置等信息。
这些数据通常以直方图的形式呈现，
可以通过专业的分析软件进行解析和统计分析。
数据分析可以帮助研究人
员确定细胞亚群的比例、亚群之间的差异和相似性等信息。
流式细胞技术在许多领域中被广泛应用。
在免疫学研究中，流式细胞
技术可以用来分析和鉴定免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，以及它们的功能状态和表达的分子。
在癌症研究中，流式细胞技术可以用
来检测肿瘤细胞和癌症干细胞，以便进行诊断和预后评估。
在生物医药研
究中，流式细胞技术可以用来评估各种药物对细胞表型、凋亡和增殖等影
响的研究。
综上所述，流式细胞技术是一种强大的细胞分析方法，能够同时检测
和分析多种细胞参数。
这种技术的原理和方法相对复杂，但其在生物医学
研究和应用中具有广泛的应用前景。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
细胞生物学流式细胞仪分析技术研究
细胞生物学流式细胞仪分析技术研究细胞生物学是生物学的一个分支，主要研究细胞的结构、功能和活动。
随着科学技术的进步，越来越多的细胞生物学研究利用流式细胞仪分析技术，这项技术已成为现代细胞生物学研究的重要手段之一。
一、什么是流式细胞仪？流式细胞仪是一种现代化的细胞生物学技术，通过细胞的物理特性分离和分析细胞，使得细胞间的差异得以更加细致地研究。
通俗来说，流式细胞术就是将需要研究的细胞通过某种方式变成单个细胞，然后运用指定的设备将这些单个细胞分类。
二、流式细胞仪有什么特点？流式细胞仪在细胞分析中的作用主要体现在如下几个方面：1、高速度：流式细胞仪一般能够分析数百个或者数千个细胞，但是也有少量最高能够同时分析几十万个细胞的超大型仪器，分析速度极快。
速度快意味着样本优选几次，可以在非常短的时间内分析出大量的样本，从而追踪细胞分析对结果的影响。
2、高精度：流式细胞仪分析的样本极具目测性，同时将数据处理相当精确，因此流式细胞仪可以准确地分析不同的细胞质、核形态及染色体。
3、多参数同时分析：流式细胞仪可以对许多参数获得同时数据。
不仅能够分解及分析荧光染料的强度及频率，这项技术还可以同时测量多个分子。
三、流式细胞仪常用于哪些领域？流式细胞仪分析技术被广泛应用于不同的研究领域和实践环境中。
其中一些领域有：1、生物医学研究：流式细胞仪在生物医学研究领域中，是一种非常有用的手段，用于分析细胞的数量和特征。
2、病毒学研究：流式细胞仪也可以应用于抗病毒抵抗性和治疗策略的研究。
3、肿瘤学研究：利用流式细胞仪可以分析癌细胞繁殖性、凋亡率、侵袭性等细胞特性，为癌症的预后及治疗方案提供有用的信息。
四、流式细胞仪实验该如何进行？流式细胞仪实验一般需要分为以下几个步骤：1、准备细胞悬液：通常使用生长良好的单细胞悬液作为分析样品。
样品为新鲜的活细胞，一般从培养物、外周血或组织雾化制得。
2、细胞净化：细胞悬液需要通过漂浮中和负离子小珠、葡聚糖或其他分离方式，使其具有悬浮性，然后进行进一步处理。
流式细胞仪分析技术
流式细胞仪分析技术流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于细胞学和免疫学研究的分析技术。
它结合了光学、生物技术和数字技术，可以迅速、准确地分析单个细胞的形态特征、生理状态、分子表达和细胞功能等。
流式细胞仪分析技术与传统的显微镜观察方法相比，具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高准确性和自动化等优势。
流式细胞仪分析技术的原理是基于细胞在流体中的特性和细胞与激发光交互作用时所产生的光信号。
具体而言，流式细胞仪通过光源产生一束激发光，并经过一系列的光路元件，将光束聚焦在细胞悬液中的细胞上。
细胞在激发光的作用下，会发出散射光和荧光光，然后通过一系列的光学滤波器和光学器件，将光信号转化为电信号，并通过光敏器件转化为数字信号。
最终，这些数字信号可以被计算机采集和分析，从而得到细胞的相关参数和信息。
1.细胞计数和细胞大小测量：流式细胞仪可以通过细胞的散射光信号，计算细胞的浓度和大小。
这对于确定细胞的增殖状态、细胞密度和细胞生长速度等具有重要意义。
2.细胞凋亡分析：流式细胞仪可以通过荧光标记技术，检测细胞凋亡相关的标志物，如细胞膜外磷脂翻转和DNA断裂等。
这对于研究细胞凋亡的发生和调控机制非常重要。
3.细胞表面标记物检测：流式细胞仪可以利用荧光标记的抗体，检测细胞表面的特定抗原或受体，从而研究细胞的分型、功能和相互作用等。
这对于免疫细胞的表型分析和免疫细胞亚群的鉴定非常有价值。
4.荧光蛋白标记检测：流式细胞仪可以利用荧光蛋白标记，检测细胞内特定蛋白的表达水平和分布情况。
这对于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等具有重要意义。
总之，流式细胞仪分析技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
它可以为研究人员提供关于细胞数量、大小、形态、生理状态、分子表达和细胞功能等多样化信息，为细胞学和免疫学的基础研究、新药研发和临床诊断等方向提供有力的支持。
随着技术的不断发展和改进，流式细胞仪分析技术将在未来发展得更加成熟和广泛应用。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析（PI法）一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min；8.用300目滤网过滤，上机检测。
细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1四、实验步骤1. 将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。
流式细胞仪技术参数
流式细胞仪技术参数一、概述流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究领域的分析仪器，可以实现对细胞的快速、准确的检测和分析。
它通过测量细胞在流动状态下的荧光、散射等信号，可以获取细胞的形态、大小、表面标记物和内部成分等信息。
而流式细胞仪的技术参数则是评估仪器性能的重要指标。
二、光源参数流式细胞仪的光源参数包括波长范围、光源类型和稳定性。
波长范围是指仪器能够发射或接收的光的波长范围，通常在350-850纳米之间。
光源类型有激光和氙气灯两种，其中激光具有单色性好、方向性强等优点，但成本较高。
而稳定性则衡量了光源输出的稳定程度，对于获得准确的实验结果非常重要。
三、散射光参数散射光是流式细胞仪中常用的检测信号之一，可以提供细胞的大小、形状和表面特征等信息。
散射光参数主要包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
FSC信号与细胞的大小和形状有关，而SSC信号则与细胞的复杂度和颗粒物含量相关。
这两个参数的灵敏度和分辨率决定了仪器对细胞的检测能力。
四、荧光参数荧光参数是流式细胞仪中应用最广泛的检测信号。
它通过检测细胞标记的荧光染料或荧光蛋白的发射光信号，可以获取细胞的表面标记物、细胞周期、细胞凋亡等信息。
荧光参数的关键指标包括激发波长、发射波长、滤光片类型和灵敏度。
激发波长是指激发光的波长范围，发射波长则是指检测荧光发射光的波长范围。
滤光片的选择对荧光信号的检测和分辨率有着重要影响。
五、速度参数速度参数是评估流式细胞仪性能的重要指标之一。
它包括流速和事件捕获率两个方面。
流速指的是细胞在流动状态下通过检测点的速度，一般在100-10000个细胞/秒之间。
事件捕获率则是指仪器每秒钟能够记录的细胞事件数，对于高通量实验非常重要。
六、采样参数采样参数是流式细胞仪中决定样本处理效率的重要因素。
它包括采样量、样本容量和样本稀释倍数等指标。
采样量是指每次采样的细胞数量，样本容量则是指样本室的最大容量。
样本稀释倍数是指样本在进入流式细胞仪之前是否需要进行稀释处理。
流式细胞仪分析技术及应用
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(一)前向散射光 激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度(0. 5°一10°)向前方散射讯号 (图)。在激光束正前方的检测器为前向散射光检测器，其收集的散射光信号又 称为小角散射，对同一个细胞群体，FS信号的强弱与细胞的体积大小呈正比， 因此可以说FS是用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性。 (二)侧向散射光 激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号。与激光束垂直方向的检测器为侧 向光检测器，也称为90°散射光检测器(图)。其收集的散射光信号主要由细胞 的致密性及粒度折射产生，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度呈正 比。由于SS对细胞膜、胞质、核膜的折射率更加敏感，特另」是对胞质中的 大颗粒成分也有光信号产生，SS用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细 胞内超微结构和颗粒性质的参数。
(二)基本工作原理 • 按检测需要标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进 人流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态单细胞液柱，液柱与水平方向的激 光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生 特异性荧光，同时，由于混合细胞群中因细胞大小和胞内颗粒多少的不同会 被激发而产生不同的散射光。光电倍增管将已接收的光电信号转换成电压脉 冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、 分析、处理按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以 图像和数据显示于荧光屏上，包括了单参数和二维或三维图像资料，阳性细 胞百分率、斜率、峰值、峰面积等多参数资料。一台好的流式细胞仪每秒可 测量15 000个细胞，测定1 000个荧光染料分子的粒子，这是目前其他仪器尚 无法做到的。 • 流式细胞仪产生分析的电信号主要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依 据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞(图 ) 。
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料介绍流式细胞仪是一种常见的生物学实验仪器，可用于快速分析、定量和分选单个细胞。
它以极高的灵敏性和精度，使其成为现代生命科学中最重要的工具之一。
流式细胞仪的应用范围非常广，包括细胞免疫学、药理学、细胞周期分析、基因表达分析等等。
本文档旨在介绍流式细胞仪的基本工作原理、检测技术和质量控制方法。
工作原理流式细胞仪通过吸收、散射和荧光等特定光学信号来检测和分析细胞。
它的核心组成部分是荧光染料和激发光源，荧光染料可以与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物，激发光源可以激活荧光染料的荧光信号。
当样品通过流式细胞仪时，细胞和细胞复合物被单独地呈现在流体中，并且被一个聚光镜系列扫描，采集特定的光学信号。
通过分析该信号，流式细胞仪可以确定每个单一细胞的荧光特性。
检测技术荧光检测流式细胞仪常用的检测方法是荧光检测。
它需要将荧光染料与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物。
流式细胞仪将样品置于聚光镜下，激发光源激活荧光染料的荧光信号，然后通过聚光镜采集荧光信号。
荧光检测既可以用来鉴定单个表面标记物，也可以用于检测内部标记。
散射检测散射检测是流式细胞仪的另一种找出单个细胞的方式。
散射检测基于细胞对激光束的散射表现，散射强度既可以用来区分不同类型的细胞，也可以用于估计细胞的大小、形状和结构。
生物素-亲合素检测生物素-亲合素检测是流式细胞仪常用的一种检测方法。
生物素-亲合素检测通过不同的化学偶联对荧光染料进行标记，使得检测定量更加精确。
质量控制流式细胞仪的检测结果受多种因素的影响，因此需要严格的质量控制程序来保证检测结果的准确性和可靠性。
质量控制程序包括实验前的设备校准和实验后的数据分析。
设备校准设备校准是流式细胞仪保证检测结果准确性和可靠性的关键。
光学器件需要定期校准，以确保检测的性能和准确性。
每个荧光探针必须进行校准，以确保正确的基线水平和探针强度。
数据分析数据分析是流式细胞仪质量控制的另一关键步骤。
流式细胞技术与图像处理
02
非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
03
实验标本的处理
细胞染色
染色要求： 特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度
首选直接标记抗体
荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
Annexin V Assay （建议用于悬浮细胞）
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。
在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
台式机 双激光四色，市场覆盖率最高
FACSAria Ⅲ
特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析
科研型分选流式细胞仪
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
鞘液
鞘液
细胞流
激光照射点
流体动力学聚焦示意图
液流驱动系统
进样速率控制
高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
光学系统
激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。
流式细胞仪 技术要点
流式细胞仪技术要点学习流式细胞仪这么久，今天来说说关键要点。
首先呢，我理解流式细胞仪最基本的一个要点就是它的样本制备。
这个可得特别小心。
样本要是没弄好呀，后面那些高大上的检测啥的全白搭了。
就好比你要做饭，食材没洗干净或者没切对，那做出来的菜肯定不好吃。
在制备样本的时候，细胞得是分散的单个状态，不能有成团的现象。
我之前就老把这个搞砸，要么细胞太密集了，要么就有杂质，搞得检测出来的数据乱七八糟的。
我总结了个小技巧，在处理样本的时候啊，每一个步骤都要很轻柔很仔细，就像对待稀世珍宝一样。
另外，流式细胞仪的荧光标记这部分也超重要。
不同的荧光染料对应检测不同的细胞特性。
我记得我一开始总是搞混几种染料的用途，后来我就专门找了个小本子，把每一种常用的荧光染料对应的功能都抄下来，闲的时候就拿出来看看加强记忆。
这就像背单词似的，多重复才能记得住。
我理解这个荧光标记就像是给细胞穿上不同颜色的衣服，这样仪器就能识别不同类型的细胞了。
比如说你标记了绿色荧光的染料在某种细胞上，在仪器检测下，那种细胞就会显示出绿色的信号。
还有还有，参数的设置也是个难点啊。
好多个参数在那儿，什么散射光参数、荧光强度参数之类的。
我有时候看着那些参数就懵，不知道从哪儿下手。
后来我就慢慢一个个地去了解每个参数的意义，多试几次不同的设置，看看检测结果有啥变化。
就类似调整相机的参数来拍出不同效果的照片一样，这个参数设置错了，可能得出来的图像就很模糊或者根本看不出关键信息。
对了还有个要点，那就是仪器的校准。
我觉得这是很容易被忽视的一点。
校准没做好，准确性就无从谈起了。
这就跟秤没校准则称东西不准是一个道理。
要准确地使用标准微球等来校准仪器，这样检测的数据才有说服力。
我知道我对流式细胞仪的技术要点理解还不是非常全面，但这些都是我实打实学习过程中的一些经验分享。
我也是在不断学习摸索。
如果想要更深入精确的知识，可以去看一些专业的书籍，像《流式细胞术原理与应用》就很不错，还有很多相关的专业论文在知网上也能找到参考。
流式细胞仪行标
流式细胞仪行标
流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是一种用于分析和分离活细胞的实验室技术。
它可以用来测定细胞的大小、复杂性（颗粒度）、内部荧光强度以及细胞表面或内部的特定分子标记。
流式细胞仪的工作流程大致包括以下步骤：
1. 样本制备：首先需要将细胞样本制备成单细胞悬液，并加入荧光染料或抗体以标记目标分子。
2. 染色：细胞悬液与荧光标记的抗体或染料混合后，孵育一段时间以使标记物结合到目标细胞上。
3. 样本加载：经过染色的细胞样本通过流式细胞仪的样本输入系统，通常是一个细管，称为流道。
4. 液流形成：细胞样本被雾化成单个细胞的液滴，这些液滴通过流道以一定速度流动。
5. 激光照射：流动中的细胞逐个经过激光束的照射。
激光激发细胞内或表面的荧光标记，使其发出光信号。
6. 信号检测：流式细胞仪配备有光电探测器，用来检测细胞发出的光信号。
每个细胞产生的信号被转换为电信号，并记录下来。
7. 数据分析：收集到的信号被计算机系统分析，根据细胞的荧光强度和散射光特性，可以得到细胞的各种参
数，如细胞大小、颗粒度、细胞膜和胞内分子的表达水平等。
8. 数据呈现：分析结果通常以二维图表（如前向散射与侧向散射图、荧光强度直方图）或三维/四维图表的形式展现，便于研究者进行进一步的数据解读和实验设计。
流式细胞仪广泛应用于免疫学、肿瘤学、细胞生物学等领域，对于疾病诊断、细胞分选、功能性研究等方面有着重要作用。
通过精确地测量和分析细胞的物理和化学特性，流式细胞仪能够提供关于细胞状态和功能的丰富信息。
流式细胞仪技术参数
一、流式细胞仪技术参数1 工作条件：1.1 电源要求: 220V (±10%)、50-60HZ1.2 环境温度:16-30℃1.3 湿度：20-80%2 用途：免疫分析、淋巴细胞亚群分析；细胞周期分析、凋亡分析；感染分析、肿瘤细胞分析；多重细胞因子分析等。
3 技术规格和参数3.1 激发系统：3.1.1 激发光源：405nm紫色固态激光器、488nm蓝色固态激光器和640nm红色固态激光器，固定光路，空间立体激发。
3.1.2 激光塑形：自动的多棱镜塑形系统，光斑大小：9x65um椭圆形光斑3.1.3 流动室规格：180x430μm3.2 荧光收集和检测3.2.1 光胶耦合物镜，数值孔径1.2，大面积收集发射荧光。
3.2.2 每一激发激光对应一个独立检测单元，光胶耦合物镜自动分开汇集每一激光激发的发射荧光进入相对应检测单元，避免光谱交叉。
*3.2.3 配备1个独立八角型全反射检测系统、2个独立三角型全反射检测系统3.2.4 光学检测系统内部采用全反射检测光路系统，荧光信号到达检测器只经过一个长通滤光片，信号能量损失最小。
3.2.5 检测系统依次优先检测易衰减的长波长信号，保证弱信号灵敏度。
*3.2.6 共计12个信号检测器，包括10个光电倍增和和2个散射光探测器。
3.2.7 荧光通道组合：405nm紫色激光器对应3个检测通道，滤光片包括450/50nm、 525/50nm、 605/40 nm；488nm蓝色激光器对应4个检测通道滤光片包括530/30nm、 575/25nm、695/40nm、780/60 nm； 640nm 红色激光器对应3个检测通道，检测滤光片包括：670/30nm、712/21nm、780/60 nm。
通道之间最低光谱交叉，滤光片带有智能芯片，直接插拔，自动识别。
*3.2.8 荧光检测灵敏: FITC<100MESF，PE<50MESF(提供英文原版参数)；CFDA检测结果FITC<5MESF，PE<5MESF（提供检测报告）。
guava 流式细胞仪 技术参数
guava 流式细胞仪技术参数Guava流式细胞仪技术参数引言：Guava流式细胞仪是一种常用的生物实验仪器，用于细胞分析和排序。
它具有高灵敏度、高通量和快速分析的特点，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物筛选等领域。
本文将介绍Guava流式细胞仪的主要技术参数，包括仪器结构、性能指标和应用范围等方面。
一、仪器结构Guava流式细胞仪由光学系统、流体系统、电子系统和数据分析系统等几个部分组成。
1. 光学系统：包括激光源、光栅和光电探测器等。
激光源产生激光束，光栅用于分光，光电探测器用于接收散射光、荧光信号等。
2. 流体系统：包括进样系统、流体控制系统和废液处理系统等。
进样系统用于将待测样品引入流式细胞仪，流体控制系统用于控制进样速度和流速，废液处理系统用于排除已经分析过的样品。
3. 电子系统：包括信号放大器、数据采集器和控制器等。
信号放大器将光电探测器接收到的微弱光信号放大，数据采集器将放大后的信号转换为数字信号，控制器控制整个流式细胞仪的运行。
4. 数据分析系统：包括数据处理软件和结果展示界面等。
数据处理软件用于对采集到的数据进行分析和处理，结果展示界面用于显示实验结果。
二、性能指标Guava流式细胞仪的主要性能指标包括散射信号检测范围、荧光信号检测范围、灵敏度、分辨率和通量等。
1. 散射信号检测范围：指流式细胞仪可以检测到的散射光信号的范围。
通常分为前向散射、侧向散射和反向散射三个方向。
2. 荧光信号检测范围：指流式细胞仪可以检测到的荧光信号的范围。
不同的荧光染料具有不同的发射波长，流式细胞仪需要具备相应的波长范围的荧光探测器。
3. 灵敏度：指流式细胞仪可以检测到的最低浓度的样品。
灵敏度越高，可以检测到更低浓度的样品。
4. 分辨率：指流式细胞仪可以区分的最小粒径差异。
分辨率越高，可以区分更小的粒径差异。
5. 通量：指流式细胞仪每小时可以分析的样品数量。
通量越高，分析速度越快。
三、应用范围Guava流式细胞仪广泛应用于细胞学、免疫学、生物医学研究等领域。
流式细胞技术意义及操作要点
将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本， 在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不 含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从 鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒 流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流 动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞 在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪 的检测区域。
§3.1 荧光探针的选择
2. 藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE） PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自 然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对 于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用 585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞 仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器 检测PE。
FITC FITC
Number of Events
Fluorescent Intensity
§2.2 工作原理
5. 数据的存贮、显示与分析
FCM数据存贮的方式均采用列表排队方式。 数据的显示通常有一维直方图、二维点图 等。
§2.2 工作原理
单参数直方图
二维散点图
§2.3 细胞分选原理
当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方 的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频 率进行振动，使液流注断裂成一连串均匀的液 滴，仅少量液滴含有细胞，有大量不含细胞的 空白液滴。当实验设计中设定了被分选的细胞 的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时会被充 电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选 参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液 滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电 荷是正或是负而发生向右或向左的偏转，落入 指定的收集器中，完成细胞分选的目的。
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能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
（二）免疫荧光标记
¾ 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
第十七章 流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
激发 波长 488
568
488
488
荧光颜 色
绿 525
红 615
橙 575
633 红 670
488 红 670
溶解性 易
不易
易
易
对PH敏感 性
特点
敏感 易溶于水，与抗体结 合不影响特异性
不敏感 稳定，偶联后量子产 额低
不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
不敏感 减少交叉，成本高
能量传递复合染料
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
1.流式细胞仪的基本结构：
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的
单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进 入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
¾ 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小 的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把 针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标 本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激 光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行 定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相 芯片”之称 。
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
洗涤
尼龙网过滤
使贴壁细胞脱落
¾新鲜实体组织单细胞悬液的制备
• 机械法 • 酶处理法 • 化学试剂处理法 • 表面活性剂处理法
¾单细胞悬液的保存
• 深低温保存法（一年） • 乙醇或甲醇保存法（2周） • 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
• 有较高的量子产额和消光系数 • 对488nm的激发光波长有较强的吸收 • 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 • 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
Flow-count
（四）免疫检测的质控
• 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照， 选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和 设置电压，以保证特异性。
• 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测， 结果达靶值，提示本次实验结果可靠。
第四节 在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式 细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析， 可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增 加了有效的手段和帮助。
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给 基因的特异性编码；而液相芯 片则是用颜色来编码）
通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析
四、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
• 适当的制备方式 • 处理红细胞 • 实体组织来源标本用机械法 • 温度25~37℃，pH7.0~7.2
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
线性门
• Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个 相关的概念，区阈可与门对应，但是也 可以包含于门。
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
（二）免疫荧光染色的质控
• 温度 • pH • 染料浓度 • 固定剂
（三）仪器操作的质控
• 光路与流路校正: 确保激光光路与样品 流处于正交状态，减少变异（CV）。
Flow-check
• PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测 时仪器处于最佳灵敏度工作状态。
Flow-set
• 绝对计数校准: 保证计数的准确性。
1.双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
绿色荧光强度
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。
• 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。
• 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。
• 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
D1 CD4+/CD3D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
• 样本制备 • 标记染色 • 液相芯片技术 • 质量控制
一、免疫检测样品制备
单细胞悬液 ¾外周血淋巴细胞样品的制备
分离单个核细胞
¾培养细胞的样品制备
蛋白酶消化 机械吹打
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
二维等高图
3. 假三维等高图
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定 其中想要分析的特定细胞群，并要求 该样本所有其他参数组合的直方图只 体现这群细胞的分布情况。