菌种鉴定标准操作规程

菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1 整体操作步骤1.1 纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。

1.2 挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。

1.3 如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。

如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE 试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E 试剂条进行鉴定。

1.4 如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。

如实验结果为阴性则选用API Strep 试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph 试剂条进行鉴定。

1.5 假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB 试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne 或其他试剂条进行鉴定。

1.6 选定正确的试剂条以后，根据不同的API 试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API 鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。

鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。

2 革兰氏染色2.1 染色剂的配制2.1.1 结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h 使用，置密闭棕色瓶中储存。

1.7 碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml 水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml ，摇匀，分装在棕色瓶中储存。

1.8 稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml ，摇匀。

2.2 操作:2.1.2 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。

2.1.3 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3 次，以固定涂片。

2.1.4 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，染色1 分钟。

2.1.5 水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。

2.1.6 滴加碘液冲去残水并媒染约 1 分钟，用纯化水冲去碘液吸干。

2.1.7 滴加95%的乙醇脱色约20～30 秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均匀，立即用水冲净。

2.1.8 稀石碳酸红溶液染色 1 分钟后，用水洗净晾干或吸干。

2.1.9 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100 倍物镜观察细菌革兰氏属性。

革兰氏阳性菌染色成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色，同时做阳性对照。

3 简单染色3.1 用于真菌与细菌的鉴别。

1.9 操作:2.3 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。

2.4 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3 次，以固定涂片。

2.5 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，染色1 分钟。

2.6 水洗：斜置玻片使很细水流的自来水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止，自然晾干或吸干。

2.7 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100 倍物镜观察菌体形态。

4 3%氢氧化钾试验2.1.10 材料3%KOH 溶液（W/V）、无菌木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物（18～24 小时）。

2.1.11 操作3.2 在一洁净的载玻片上等距离滴上 3 滴3%KOH 水溶液。

3.3 用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照。

3.4 用枯草芽胞杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照。

3.5 用木质牙签从培养基上分别挑取阳性，阴性和待检菌的新鲜纯培养物（18～24 小时）于载玻片上的 3 滴KOH 水溶液中。

3.6 然后用牙签快速环形搅动30～60 秒后，轻轻地向外拉该菌悬液，如果是革兰阴性细菌，在菌悬液和牙签之间有黏丝出现，如果是革兰阳性细菌则无黏丝出现。

3.7 结果判断4.2.6.1 如果在15 秒钟之内溶液的黏性增强并有黏丝形成，则认为该试验菌株的氢氧化钾呈阳性，试验菌株为G-。

4.2.6.2 如果溶液不产生粘丝，则试验菌株被判断为氢氧化钾试验阴性，试验菌株+。

为G4.2.6.3 当阳性和阴性试验结果均为典型反应时，该实验才有效。

5 触酶试验（过氧化氢酶试验）5.1 细菌代谢产生的过氧化氢对细菌细胞具有毒副作用，而细胞内的接触酶能催化过氧化氢，将其分解为分子态氧，使其解毒。

向含有接触酶的细菌培养物滴加过氧化氢溶液后即产生大量气泡（阳性）。

5.1 材料3%过氧化氢溶液、无菌木质牙签、洁净载玻片、滴管。

5.2 操作2.8 用无菌木质牙签挑取新鲜待检菌的纯菌苔置于洁净的载玻片上。

2.9 向玻片上的菌落滴加3%过氧化氢溶液一滴；或于琼脂培养物上直接滴加3% 过氧化氢溶液试液。

2.10 结果判断：立即观察结果，产生气泡为阳性反应，不产生气泡者为阴性反应。

用金黄色葡萄球菌或具等同性质的菌种重复以上步骤作为阳性对照，并用铜绿假单胞菌或具等同性质的菌种作为阴性对照。

2.11 注意事项2.1.12 阴性控制和阳性控制必须为典型反应时，该实验才有效。

2.1.13 当将过氧化氢溶液加到生长于血琼脂平板上的菌落时会产生假阳性结果（因为红细胞中含有过氧化氢酶）。

2.1.14 必须将过氧化氢酶溶液滴到菌落上，操作顺序不能颠倒，否则会产生假阳性结果。

2.1.15 不要用铂金类接种针或接种环去混合培养物和过氧化氢酶水溶液，因为接种针的铂金可以会引起假阳性结果。

因此在这个试验中，应用木质无菌牙签或是塑料类无菌接种环。

6 葡萄糖氧化/发酵试验3.8 氧化发酵培养基中含有较低浓度蛋白胨和较高浓度碳水化合物，待检细菌通过氧化或发酵利用葡萄糖产酸，使其pH 值下降，培养基中的指示剂由绿色变成黄色。

4.2.6.4 材料5.2 无菌矿物油：液体石蜡121℃半小时高压蒸汽灭菌。

5.3 氧化发酵培养基：葡萄糖10g，胰蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，溴麝香酚蓝0.08g，去离子水1000ml ，pH6.6-7.0 。

分装于13×100mm 小试管中，121℃灭菌15 分钟。

竖直放置待其凝固后使用。

4.2.6.5 操作6.2.1 打开小试管。

1.10 用接种针挑取分离的单个纯菌落，刺入氧化发酵培养基约1cm 深，分别接种两个试管。

1.11 向其中一只试管内加入无菌矿物油，覆盖在培养基表面约1cm 高，作为发酵管（OF/F）；另一支不加矿物油作为氧化管（OF/O）。

1.12 以同样的方法在试管中接种大肠埃希菌或者是等同菌株作为阳性对照，接种铜绿假单胞菌或者是类同菌株作阳性对照。

2.12 培养：将接种后的发酵培养基放入35～37℃的培养箱中培养24 小时后观察结果，若结果呈阴性，则继续培养24 小时。

2.13 结果判断2.1.16 培养基变为黄色，反应结果记为阳性。

2.1.17 培养基仍保持均匀的绿色，反应结果记为阴性。

2.1.18 如果培养基的颜色由绿色变为蓝色，是由微生物产碱反应所致，记为阴性。

7 细胞色素氧化酶试验细胞色素氧化酶是一种铁卟啉类的酶，它将还原的细胞色素 C 氧化后以非活性的还原态存在。

而还原的细胞色素氧化酶因将电子传递给分子氧而又变成活性态。

在分子氧的存在下，细胞色素氧化酶和细胞色素 C 系统能还原一系列有机物。

其中，它将指示条反应区的α–萘酚和二甲基对苯二胺还原，会形成吲哚酚蓝分子，通过这一反应将细菌进行分类和鉴别。

3.9 材料细胞色素氧化酶检测指示条,指示条反应区的主要成分：二甲基对苯二胺0.1μmol、α-奈酚1.0μmol。

3.10 操作4.2.6.6 用牙签从培养基上挑取生长良好的单一菌落（菌落的pH 值不得低于 6.0，否则会出现假阴性结果）。

4.2.6.7 将菌落均匀涂在反应带上，过20～60 秒后，比较反应带的颜色。

4.2.6.8 若反应带变为紫到深紫色则为阳性反应，不变色或黄色为阴性反应。

8 基于系统发育分析的16S rDNA 序列测定与比对5.4 当药品无菌检查阳性或培养基灌装试验阳性时，需对基污染菌及与该污染菌相似的菌种进行分子水平上的菌种鉴定。

该类样品则其中送往测序公司进行序列测定。

9 洁净区环境控制-微生物鉴定表环境级别区域鉴定范围空气A 级人员鉴定至种表面空气鉴定至属（地面-革兰氏B 级人员染色）表面空气超标鉴定至属，其他革 C 级表面兰氏染色其他革兰氏染色附件：附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图相关文件与记录：无培训范围：质量控制部全体人员参考文献：无编制历史与变更原因：本规程属于海南** 制药有限公司第一版文件。

版次号修订内容描述生效日期00 初建附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图API 20NE阴性API 20E阳性杆菌发酵实验-细菌G形态观察球菌-G 球菌革兰氏染色菌种纯化杆菌+细菌G形态观察球菌API Strep阴性过氧化氢酶内生芽孢API Staph阳性API阴性API阳性。