第二章 蛋白质-2
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第二章蛋白质的组成及物理化学性质
Met
M
5.74
2. 极性中性氨基酸
• Gly、Ser、Tyr、Cys、Thr、Asn、Gln • Cys侧链的巯基失去质子的倾向较其它氨基 酸大，极性最强 • Gly侧链介于极性与非极性之间
2. 极性中性氨基酸
H
CHCOONH3+
甘氨酸 丝氨酸 酪氨酸
glycine
Gly
G
5.97
serine tyrosine
PTC- 氨基酸 苯氨基硫甲酰氨基酸
S
C
N H R
40℃， H+ 、硝基甲烷
N S
C N H C CH R O
可用层析法鉴 定出aa的种类
PTH- 氨基酸 苯硫乙内酰脲氨基酸
4. 重要的化学性质
Edman反应
此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理
4. 重要的化学性质
丹磺酰氯（DNS）反应
此反应可用于测定肽链N端氨基酸的种类
R
O2 N
R
F ＋ H2N CH COOH
NO2
O2 N NO2
HN
CH
COOH ＋ HF
DNFB
DNP - 氨基酸
此反应最初被Sanger 用于测定肽链 N-端氨基酸
4. 重要的化学性质
R H2N CH COOH ＋
Edman反应
N C S
PITC
异硫氰酸苯酯
40℃，弱碱
H N OH C CH O
arginine
Arg
R
10.76
组氨酸
histidine
His
H
7.59
蛋白质的稀有氨基酸
• 蛋白质的稀有氨基酸是基本氨基酸的衍生物，没 有相应的三联密码子
动物生物化学 第二章 蛋白质
肽链内形成氢键，氢键的取向 几乎与轴平行，第一个氨基酸 残基的酰胺基团的-CO基与第 四个氨基酸残基酰胺基团的NH基形成氢键（包含13个原 子）。
蛋白质分子为右手-螺旋。
（1）-螺旋
-螺旋
表 几种螺旋结构参数
结构类型 残基/圈 1个氢键环的原子数 每个残基高度（nm） Φ Ψ
310螺旋 3.0
位 置
及顺序分析，
的 然后同其它方法分析的肽段进行比较，
确 确定二硫键的位置。
定
2.4 蛋白质的高级结构
2.4.1 肽单位平面结构和二面角
O
O
O
H
H
H
H2N
C
C
N H
C
C
N H
C
C
R
R
R
N端
肽单位
肽单位
O
H
H
NH C C N C COOH
H
R
R
C端
肽单位： 主肽链中的重复单位
肽键平面—由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相 连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。
蛋白质构件分子是氨基酸。 氨基酸是蛋白质的基本单位。 自然界存在的氨基酸有300多 种，但合成蛋白质的氨基酸只 有20种，都属于α-氨基酸，其 中除甘氨酸外，其余都是L-α氨基酸。
蛋白质分子中的20种 氨基酸在DNA分子中有它 们特异的遗传密码相对应，
因而也称编码氨基酸 （Coding amino acid）。 新近发现的硒代半胱氨酸 （SeCys）也是一种编码 氨基酸。
由 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 称 为 二 肽 ， 由 多 个 氨 基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状， 所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称 为氨基酸残基。
蛋白质分子为右手-螺旋。
（1）-螺旋
-螺旋
表 几种螺旋结构参数
结构类型 残基/圈 1个氢键环的原子数 每个残基高度（nm） Φ Ψ
310螺旋 3.0
位 置
及顺序分析，
的 然后同其它方法分析的肽段进行比较，
确 确定二硫键的位置。
定
2.4 蛋白质的高级结构
2.4.1 肽单位平面结构和二面角
O
O
O
H
H
H
H2N
C
C
N H
C
C
N H
C
C
R
R
R
N端
肽单位
肽单位
O
H
H
NH C C N C COOH
H
R
R
C端
肽单位： 主肽链中的重复单位
肽键平面—由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相 连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。
蛋白质构件分子是氨基酸。 氨基酸是蛋白质的基本单位。 自然界存在的氨基酸有300多 种，但合成蛋白质的氨基酸只 有20种，都属于α-氨基酸，其 中除甘氨酸外，其余都是L-α氨基酸。
蛋白质分子中的20种 氨基酸在DNA分子中有它 们特异的遗传密码相对应，
因而也称编码氨基酸 （Coding amino acid）。 新近发现的硒代半胱氨酸 （SeCys）也是一种编码 氨基酸。
由 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 称 为 二 肽 ， 由 多 个 氨 基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状， 所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称 为氨基酸残基。
第二章 蛋白质
第二节 氨基酸
(2)碱法水解 (3)酶法水解 选择合适的蛋白酶，在适当的 pH和温度条件下与蛋白质溶液混匀，保温， 经一定时间得到所需的水解产物。 啤酒工业中用蛋白酶水解大分子蛋白质可 除去蛋白质混浊。增加产品稳定性。 (4)稀酸、稀碱水解
第二节 氨基酸
二、氨基酸的结构和分类 1、常见氨基酸 2、蛋白质分子中的稀有氨基酸
第一节 概述
二、蛋白质的化学组成 1、元素组成： 主要有C、H、O、N和少量S 有些蛋白质还有P、Cu、Fe、Mn、Mo、Co、 Zn、Mg、Ca等矿质元素
蛋白质换算系数
第一节 概述
2、蛋白质大分子的化合物组成 两种类型：单纯蛋白质和结合蛋白质
第一节 概述
单纯蛋白质：完全水解产物只有α-氨基酸。 结合蛋白质：由单纯蛋白质与耐热的非蛋白 质物质结合而成的，其非蛋白质部分称为 辅基。 结合蛋白质分子＝单纯蛋白质+辅基
第二章 蛋白质
第一节 概述
一、蛋白质的概念 二、蛋白质的化学组成 三、蛋白质的分类 四、蛋白质的分布和生物学意义
第一节 概述
一、什么是蛋白质 蛋白质是一切生物体中普遍存在的， 由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大 分子；其种类繁多，各具有一定的相对分 子质量、复杂的分子结构和特定的生物功 能；是表达生物遗传性的一类主要物质。
第一节 概述
2、蛋白质的生物学作用 (1)形态学功能：生物体的各种组织结构都有 蛋白质参加构成，如动物的角、毛、肉等 形态结构的干物质主要成分都是蛋白质。 (2)生理活性功能：如酶的催化作用，糖蛋白 的细胞识别作用 (3)外氨基酸
一、蛋白质的水解 二、氨基酸的结构和分类 三、氨基酸的理化性质 四、氨基酸的分离制备和分析鉴定
生物化学 第二章 蛋白质化学 上
一 氨基酸的一般结构特征
氨基酸的基本结构特征：
•酸性：
•碱性：
•手性（旋光性）：
•特异性
蛋白质是由20种L-型 的α-氨基酸构成。
非极性氨基酸（6个）
极性不带电荷（6个）
芳香族（3个）
带电荷（5个）
二 氨基酸的分类和结构 1．按照氨基酸侧链的极性分类 非极性氨基酸：Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种 极性不带电荷：Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七种 带正电荷：Arg, Lys, His（碱性氨基酸） 带负电荷：Asp, Glu（酸性氨基酸）
胶联剂、可制作金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆。
第二节 蛋白质的组成单位-氨基酸
发现：
法国化学家H Braconnot 纤维素酸热解---葡萄糖（单体） 明胶酸热解----含氮化合物（甘氨酸） 肌肉酸水解---含氮化合物（含氨基和羧基）---氨基酸 蛋白质的基本组成单位是（***）氨基酸（amino acid，AA）
3 根据组成分类 简单蛋白质 分子中只有氨基酸 结合蛋白质 简单蛋白+非蛋白成分，
也称复合蛋白质（conjugated protein）或全蛋白质（holoprotein） 结合蛋白根据结合的非蛋白成分进一步分为：
① 色蛋白（chromoprotein）色素+Pr
血红素蛋白；细胞色素类（蛋白）；叶绿素蛋白；血蓝蛋白；黄 素蛋白
Tyr、Phe
Trp
N
红色 胍基 Arg
酚试剂反应 (Folin-Cioculteu 反应)
Ellman反应
碱性 CuSO4 及磷 钨酸-钼酸
二硫硝基苯甲酸 DTNB
第二章蛋白质的结构与功能PPT课件
生物氧化和能量代谢
分子生物学基础
复制、转录、翻译、表达 调控、重组DNA技术
.
8
牛奶加鸡蛋的早餐是否合理？ 多吃糖，让人发胖，原因何在？ 人为什么要呼吸？ 维生素、矿物质不能变成热量，为什么必须摄取？ 糖尿病患者血糖为何升高？ 胰岛素治疗糖尿病机理何在？
药物、毒物如何被排出体外？
黄疸如何发生？
子女与父母在多方面相似，.为什么？
赖
缬
异
假设来写. 一两本书
亮 23
二 、氨基酸的理化性质
1、两性解离及等电点
*氨基酸的等电点(isoelectric point,
pI)
.
24
2、紫外吸收：280nm 芳香族氨基酸，共轭双
键
3、茚三酮反应：
蓝紫色化合物, 570nm,
氨基酸的定量分析
.
25
三、肽键与肽*
二肽
寡肽
多肽
蛋白质
.
26
氨基酸残基
SUCCESS
THANK YБайду номын сангаасU
2020/6/22
.
27
*谷胱甘肽（glutathione, GSH）
γ-酰胺键
Cys
H
Gly
Glu
.
28
第二节 蛋白质的分子结构
蛋白质是氨基酸通过肽键连接形成的具有三维结构的生 物大分子。在研究中，一般将蛋白质分子的结构分为四个层次。
一级结构 二级结构
of
hemoglobins（血红蛋白）. , the oxygen-
14
The protein keratin （角蛋白） is the chief structural components of. hair, scales, horn, 15
生物化学第二章蛋白质知识点归纳
一、概述
结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。按辅基种类分为： 1 核蛋白（nucleoprotein ） 核酸 2 脂蛋白（lipoprotein ） 脂质 3 糖蛋白（glycoprotein） 糖 4 磷蛋白（phosphoprotein） 磷酸基 5 血红素蛋白（hemoprotein ） 血红素 6 黄素蛋白（flavoprotein ） FAD 7 金属蛋白（metallaprotein ） 金属
据R基团 极性分类
例外：
COO+α
H3N C H
R
Gly —— 没有手性
构型与旋光方向没有直接对应关系，L-α-氨基酸有的为左旋，有的为右旋， 即使同一种L-α-氨基酸，在不同溶剂也会有不同的旋光度或不同的旋光方向。
二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号
据R基团化学 结构分类
脂肪族ＡA（烃链、含羟基或巯基、羧基、碱性基团） 杂环ＡＡ(His、Pro) 芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)
6 结构蛋白（structural protein）
7 防御蛋白（defense protein） 8 异常蛋白 (exotic protein)
二
氨基酸
1.蛋白质的水解 2.氨基酸的结构与分类 3.氨基酸的理化性质
一、蛋白质水解
完全水解得到各种氨基酸的混合物； 部分水解通常得到肽片段及氨基酸的混合物。 氨基酸是蛋白质的基本结构单元。 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成，这20种
一、概述
按生物功能分：
1 酶（enzyme）
2 调节蛋白（regulatory protein）
3 转运蛋白（transport protein） 4 储存蛋白（nutrient and storage
第二章 蛋白质组成及结构
2、蛋白质家族与超家族（protein
family and superfamily）
1、同源蛋白质（homologous protein ）
定义：结构和功能类似的蛋白质。包括来自同一
祖先，随趋异进化为结构类似和功能差异的蛋白
质（也包括在一定条件下，由不同祖先趋同进化
为结构和功能类似的蛋白质）。
产生变异原因：
苯丙氨酸
酪氨酸
色氨酸
3.羟基氨基酸与含硫氨基酸
丝氨酸（Ser, S） 半胱氨酸（Cys, C）
苏氨酸（Thr, T）
甲硫氨酸（Met, M）
Cys在蛋白质中属希有残基（2%）。
Serine Ser、 S
Threonine Thr T
●侧链带有羟基，可形成氢键, 也可通过水分子间接形成氢键 ●羟基化学性质活泼，具有重要的功能，如磷酸化，糖基化。 ●苏氨酸为必需AA，而丝
酶促催化丝氨酸而形成硒代半胱氨酸，再进酸，称非蛋白氨基酸。
它们多是基本氨基酸的衍生物（包括D-氨基酸、β、γ、δ-氨基酸），部 分是代谢物前体或中间物（如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸的中间物，β-
丙氨酸是遍多酸（泛酸，辅酶A前体）的前体，γ-氨基丁酸是传递神经冲动
插入外）的氨基酸相同，才可能属于同一家族，15%-25% 的残
基相同者属于准同源；
同源蛋白质拥有共同的三维结构和高度保守的氨基酸（如维持 胰岛素结构：24AA（多为非极性）,6Cys,3对二硫键）。
2、蛋白质家族与超家族
蛋白质家族（family)和超家族(superfamily)尚无明确定义， 有时可通用 。 蛋白质家族：一般将序列及结构域同源、进化上相关、且功能 相同的蛋白质归为同一家族。常常是基因家族的同义词。
生物化学第二章 蛋白质
第二章
蛋白质
目 录
一、蛋白质的种类、含量与分类 二、氨基酸 三、肽 四、蛋白质的结构 五、蛋白质的性质 六、食物中的蛋白质 七、蛋白质的分离与纯化
一、蛋白质的化学组成与分类
主要组成元素：C、H、O、N、S 及 P、Fe、 Cu、Zn、Mo、I、Se 等微量元素。 百分数约为：碳占50~55%，氢占6~8%， 氧占20~30%，氮占15~18%及硫占0~4%。 大多数蛋白质所含氮素约为16%，因该元素容 易用凯氏(Kjeldahl)定氮法进行测定。 故蛋白质的含量可由氮的含量乘以 6.25(100/16)计算出来: 即：蛋白质含量＝6.25×样品含氮量
aa向正极移动 aa向负极移动 aa不移动
pI的测定：
酸碱滴定法； 基于aa所带基团 均可解离； 得到弱酸弱碱曲 线； 根据aa上可解离 基团的pK值计算 等电点： pK：解离常数。 以甘氨酸为例：
由此可知：
在生理pH内，aa 的羧基和氨基全部解离； 具有这种性质的物质称两性电解质； 带有相反基团的分子叫两性离子； 滴定中Gly的阳离子（R+）、阴离子（R-） 和两性离子（R°）的比例随pH而变； 当溶液中只有两性离子时， pH = pI
蛋白质氨基酸
蛋白质中存在的20种氨基酸，除脯氨酸外，在其 α -碳原子上都有一个自由的羧基及一个自由的氨基； 由于脯基酸的α -氨基被取代，它实际上是一种α -亚 氨基酸。此外，每种氨基酸都有一个特殊的R基团。
生物体内常见氨基酸的分类：
蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20 种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些 稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。 如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。 非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨 基酸。
蛋白质
目 录
一、蛋白质的种类、含量与分类 二、氨基酸 三、肽 四、蛋白质的结构 五、蛋白质的性质 六、食物中的蛋白质 七、蛋白质的分离与纯化
一、蛋白质的化学组成与分类
主要组成元素：C、H、O、N、S 及 P、Fe、 Cu、Zn、Mo、I、Se 等微量元素。 百分数约为：碳占50~55%，氢占6~8%， 氧占20~30%，氮占15~18%及硫占0~4%。 大多数蛋白质所含氮素约为16%，因该元素容 易用凯氏(Kjeldahl)定氮法进行测定。 故蛋白质的含量可由氮的含量乘以 6.25(100/16)计算出来: 即：蛋白质含量＝6.25×样品含氮量
aa向正极移动 aa向负极移动 aa不移动
pI的测定：
酸碱滴定法； 基于aa所带基团 均可解离； 得到弱酸弱碱曲 线； 根据aa上可解离 基团的pK值计算 等电点： pK：解离常数。 以甘氨酸为例：
由此可知：
在生理pH内，aa 的羧基和氨基全部解离； 具有这种性质的物质称两性电解质； 带有相反基团的分子叫两性离子； 滴定中Gly的阳离子（R+）、阴离子（R-） 和两性离子（R°）的比例随pH而变； 当溶液中只有两性离子时， pH = pI
蛋白质氨基酸
蛋白质中存在的20种氨基酸，除脯氨酸外，在其 α -碳原子上都有一个自由的羧基及一个自由的氨基； 由于脯基酸的α -氨基被取代，它实际上是一种α -亚 氨基酸。此外，每种氨基酸都有一个特殊的R基团。
生物体内常见氨基酸的分类：
蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20 种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些 稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。 如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。 非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨 基酸。
第二章 蛋白质(new)
即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg，
占人体干重的54%。
一、体内蛋白质功能 1．组织 构成成分 2．构成各种 重要生理物质
机体组织*
约16.7 kJ (4.0 kcal)/g
3．供能
酶 抗体 激素等
蛋白质 正常人体内Pro 约为16-19%
动态平衡
一切生命的物质基础
分解
合成
每天约3%的 Pro被更新
5、增强免疫力 机体体液免疫主要由抗体和补体完成，构成白 蛋白和抗体补体需有充足的蛋白质。吞噬细胞的 作用与摄入蛋织。长期缺乏蛋白 质，这些组织显著萎缩，失去制造白细胞和抗体 的能力，吞噬细胞在质和量上都不能维持常态， 使机体抗病力下降，易感染疾病。
四、食物蛋白质的营养评价 通常将营养价值较高的蛋白质称为完全蛋白 质或优质蛋白质，如蛋、乳、鱼、肉和大豆等。 而将营养价值较低的蛋白质称为不完全蛋白质， 如一般植物性食品及由结缔组织而来的白明胶。
2、蛋白质的消化率 是指一种食物蛋白质可被消化酶分解的程度。 蛋白质消化率愈高，则被机体吸收利用的可能性 越大，营养价值也越高。食物中蛋白质的消化率 可由人体或动物实验测得，以蛋白质中能被消化 吸收的氮的数量与该种蛋白质含氮总量的比值来 表示。
免疫球蛋白是机体受抗原（如病原体）刺激 后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生 成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危 害，使病原体失去致病作用。
如果反复注射丙种球蛋白，因其本身可作为 抗原，刺激人体产生一种对抗丙种球蛋白的抗体 ，即抗抗体，一旦再注射丙种球蛋白，就会被抗 抗中和，不能发挥其抗病作用。
CH2
蛋白质
一、食物中的蛋白质种类
1.按组成成分分
1）单纯蛋白质（simple protein）：除氨基酸构成 的多肽蛋白外，没有任何的非蛋白质成分的蛋白 质。如清蛋白、白蛋白、组蛋白、鱼精蛋白等。 2）结合蛋白质（conjugated protein）：单纯蛋白 质与非蛋白质成分（碳水化合物、油脂、核酸、 金属离子等）结合而成的蛋白质。如糖蛋白、脂 蛋白、核蛋白和色蛋白等。
蛋白质的结构与功能(2)
NH3+
+H+
R CH COO - +OH- R CH COO-
NH3 +
+H+
NH2
pH<pI
阳离子
pH=pI
氨基酸的兼性离子
pH>pI
阴离子
38
总结
a、各种aa的pI不同； b、同一pH下，各种aa所带电荷不同；用
离子交换、电泳将aa分开。 pH＜pI ：aa+ pH＞pI：aac、处于pI时，aa溶解度最小，易沉淀； 可分离aa。
26
半胱氨酸
-OOC-CH-CH2-SH + HS -CH 2-CH -COO -
+NH3
-HH
+ NH3
-OOC -CH -CH 2-S S -CH 2-CH -COO -
+ NH 3
+ NH 3
二硫键
胱氨酸
27
28
三、稀有氨基酸(也称修饰氨基酸)
是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。 （1）4-羟脯氨酸 （2）5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。 （3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)г-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。 （5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋
第二章 蛋白质的结构与功能 Chapter 2 Structure and Function of
Protein
1
第一节 蛋白质的一般概念
生命是蛋白体 的存在方式，这种 存在方式本质上就 在于这些蛋白体的 化学组成部分的不 断自我更新。
恩格斯《反杜林 论》1878
第二章 蛋白质
第二节 肽
一、肽、肽链和肽键
氨基酸与氨基酸之间通过α -氨基和α -羧基形成酰胺键共价地 结合在一起,这样形成的产物叫做肽（Peptide）。
在蛋白质化学中，这种酰胺键称为肽键（Peptide bond）。
由氨基酸借肽键所形成的一条线性的链状分子就叫做肽链 (peptide chain) 。在肽链结构中,每个的氨基酸不再是完整的， 因此叫做氨基酸残基（residue）。
第二章 蛋白质
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
氨基酸 肽 蛋白质的分离与鉴定 蛋白质的结构 蛋白质的变性与复性
蛋白质概述
蛋白质-英文为“Protein”——第一重要
生老病死，万物轮回(蛋白质层次)
生（诞生、生长）：在蛋白质（酶）控 制（催化）下的老细胞计划性凋亡和新细胞的 再生（细胞新陈代谢）、活细胞物质的代谢。 老？ 蛋白质功能的普遍衰退(?)。
提问：什么是α-氨基酸？
----C-C-C-C(NH2)-COOH
----C-C-C (NH2)- C - COOH
α-氨基酸
β-氨基酸
----C-C (NH2)- C - C - COOH γ-氨基酸
（二）氨基酸侧链的性质与分类
常见的蛋白质氨基酸有20种
20种都是-氨基酸 除甘氨酸(Gly)外， -C都是不对称碳原子，且 都为L-构型 脯氨酸(Pro)不含游离的氨基，为亚氨基酸 半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)含有S元素
五、 氨基酸的化学性质
1、与茚三酮的反应
弱酸 加热 茚三酮
<氨基与羧基共同参加的反应>
脱羧，脱氨
还原茚三酮
脯氨酸与茚三酮反应生成亮黄色化合物 天冬酰胺--棕色
《生物化学简明教程》第四版-第二章蛋白质
1）与茚三酮的反应
❖ 氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧 化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合 茚三酮变为还原型茚三酮。
❖ 加热过程中酮酸裂解，放出CO2， 自身变为少一个碳的醛。水合茚三 酮变为还原型茚三酮。
❖ NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱 水缩合，生成蓝紫色化合物。
脯氨酸与茚三酮反应的产物：
苏氨酸(a-氨基-b-羟基丁酸)* Threonine
半胱氨酸(a-氨基-b-巯基丙酸) Cysteine
酪氨酸(a-氨基-β-对羟苯基丙酸) Tyrosine
天冬氨酸(a-氨基丁二酸) Aspartic acid
谷氨酸(a-氨基戊二酸) Glutamic acid
赖氨酸(a,w-二氨基己酸)* Lysine
R
H2N—CH—COO在碱性溶液 中的氨基酸
（pH＞pI）
调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3 基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷 为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的 等电点（pI）。
（当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的 α-氨基，α-羧基是可以离子化的。）
解离原则：
举列 ：计算丙氨酸的等电点
推导过程
N+H3 OH-
H3C C COOH
N+H3 H3C C COO- + H+
H
H
Ala+
Ala
N+H3
NH2
OH-
H3C C COO-
H3C C COO- + H+
H
H
Ala
Ala-
K’1=
[ Ala ] [H+] [Ala+]
生物化学 第2章 蛋白质(2)
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 3 材料的选择； 蛋白质初步提纯；
2 组织匀浆的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；
5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白 质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋 白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质 特定的折叠结构受到破坏。
600g,3 min.上清 沉淀：细胞核 6000g,8 min.上清 沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体 沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片 沉淀：核糖体亚基
40000g.30 min.上清 100000g.90 min.上清
细胞液
平衡密度梯度离心： 用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地下 沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质的 密度范围宽于被分离组分的密度。
二 蛋白质一级结构测定 蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质 样品。 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据 考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的 分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋 白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对 该蛋白质进行定量分析。
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• 盐溶：低浓度时中性盐能增加蛋白 质的溶解度 • 盐析：当溶液的离子强度增大到一 定数值时，溶解度开始下降，当离 子强度达到足够高时，许多蛋白质 从水溶液中沉淀出来
有机溶剂沉淀法
在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由 于这些溶剂与水的亲和力强，能破坏蛋白质的水化层，使 蛋白质的溶解度下降而沉淀。
利用这种吸附能力的差异，可将蛋白质进行分离。
应用最广的吸附剂：结晶磷酸钙
亲和色谱法
不同蛋白质分子对固定在载体上的特殊配基具有不同 的识别和结合能力 常用的配基有：抗体、抗原、激素、受体蛋白等 将这种连有配基的载体装入色谱柱中，当含有待纯化 的蛋白质溶液通过色谱柱时，该蛋白与配基发生特异 性结合被吸附在色谱柱上，以适当的配体洗脱液洗脱。
2.4.3
蛋白质的分离和纯化
1.蛋白质的分离
蛋白质存在于生物体的组织细胞中，在分离纯化之前必须采 用适当方法使蛋白质以溶解状态释放出来
组织破碎 细胞破碎（研磨法、超声波法、冻融法、酶解法等）
细胞破碎后，各种蛋白质被释放出来，根据不同蛋白质的特 性，选择不同的溶剂进行抽提。
水溶性蛋白 脂溶性蛋白 缓冲溶液+盐溶 有机溶剂
蛋白质在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排 斥力最小，易聚集形成沉淀 当蛋白质混合物溶液的pH被调到某一成分的等电点时， 该蛋白质被沉淀出来 那些等电点高于或低于该pH的蛋白质仍留在溶液中
盐析法
盐析：大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入 蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因 素而沉淀 各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同.
无氧存在时，与水结合，生成脱氧血红蛋白（Hb）
有氧存在时，与氧结合成氧合血红蛋白（HbO2）
血红蛋白的主要功能是运输氧和CO2
呼吸作用产生的CO2能与氧合血红蛋白结合，促进 HbO2的分解
pH=7.2（肌肉）
HbO2 +
H
+
+ CO2
pH=7.6（肺）
HbHCO2 + O2 碳酸血红蛋白
可逆沉淀
通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中 沉淀分离，此过程中，结构和性质都没有发生变化 破坏了胶体溶液的稳定性 是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
不可逆沉淀
• 在强烈沉淀条件下，不仅破坏蛋白质胶体的稳定性，而且 也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的沉淀不可能再溶于 水。
• 造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重 金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。 • 复性：有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，能恢 复活性。
5、蛋白质的紫外吸收
Trp、Tyr、Phe在280nm处有特征吸收峰，可作蛋白质 定量测定
6、蛋白质的呈色反应
双缩脲反应
氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度。 米伦反应 蛋白质黄色反应 乙醛酸反应 坂口反应 酚试剂反应
蛋白质黄色反应
• 蛋白质溶液加硝酸后产生白色沉淀，加热后白色沉淀变黄 色，再加碱，颜色加深为橙黄色。 • 原理：硝酸将蛋白质分子中苯环硝化，产生黄色硝基苯衍 生物 • 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及含有苯丙氨酸、酪氨酸、色 氨酸的蛋白质有此反应
乙然后沿试管壁慢慢注入浓硫 酸，在两液层间会出现紫色环 • 凡含有吲哚基的化合物都有此反应 • 色氨酸及含色氨酸的蛋白质有此反应
常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等
为防止蛋白质在此过程中变性，有机溶剂浓度不能太高， 需在低温条件下进行。
3) 根据电性质不同的分离方法
离子交换法 电泳法
离子交换法
利用离子交换树脂做柱色谱支持物，将带有不同电荷 的蛋白质进行分离的方法。
在蛋白质的分离中最常用的是阳离子交换树脂 固定相 负电荷 交换相 正电荷
角蛋白
•毛发、指甲、羽毛为角蛋白。
分为：α-角蛋白、 β-角蛋白
哺乳动物角蛋白为α-角蛋白
α-角蛋白由α螺旋构象的多肽链组成 3条α螺旋 原纤维
• α-角蛋白富含半胱氨酸,并与邻近的多肽链交 联,形成二硫键,因此α-角蛋白很难溶解,不溶 于水，为硬蛋白，也经受得起一定的拉力。
• α-角蛋白被过渡拉伸时，氢键被破坏不能复 原，转变为β折叠结构，称为β-角蛋白 • 鸟类及爬行类为β-角蛋白。
当蛋白质混合物溶液的pH<所含蛋白质的pI时，各种不 同的蛋白质都带正电荷 将这种蛋白质混合溶液加到色谱柱后，带正电荷的蛋白 质颗粒即与H+进行交换被吸附在树脂上
带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的 蛋白质与树脂结合较弱 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl进行梯度洗脱，通 过Na+的离子交换作用，可将带有不同正电荷的蛋白质 进行分离。
• 毛料衣服易被蛀掉: • 是由于一类蛾的幼虫消化液中有大量巯基化合 物，使二硫键还原成巯基，肽链之间的聚合被 解除，肽链被消化。 • 烫发剂，含巯基化合物，打开二硫键
• 固定剂，氧化剂，重建二硫键
丝蛋白
• 丝蛋白是反向β折叠，牢固但不能拉伸 • 丝蛋白肽链通常由六肽单元重复而成
(Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n
用已知相对分子量的蛋白质作
为标准，可估算出不同蛋白质 的相对分子量。
在一定的凝胶浓度下，
标准蛋白分子量
多肽链分子量的对数与
多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通
过标准曲线求未知多肽
链分子量。 未 知 蛋 白
相对迁移率
4) 根据吸附性质不同的分离方法
吸附色谱法
某些物质对不同种类的蛋白质具有不同程度的吸附能力。
在pH<pI溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动;
这种现象称为蛋白质电泳。
利用蛋白质的电泳现象，可将蛋白质进行分离纯化 .
2、蛋白质的胶体性质
蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体 这是因为：
蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水
基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；
CH2 CH H3C N Fe N H3C CH2 CH2 COOH CH2 CH2 COOH N CH3 N
吡咯
CH3 CH CH2
血红素
血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配位键与肽 链分子中组氨酸咪唑基的N原子相连
O2 CO2
His
CO HCO2H+
血红蛋白中，血红素Fe原子的第6配位键可与不同 的分子结合
另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质
颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀
3、蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性与它的相对分子量大小、所带的 电荷、水化作用有关。 改变溶液的条件，破坏蛋白质胶体的稳定性，在适当的条 件下，蛋白质能从溶液中沉淀出来 沉淀可分为：可逆沉淀、不可逆沉淀
电泳法
蛋白质溶液的pH≠pI时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷 由于蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场 中移动的速率也不同
v
Eq f
蛋白质与介质的摩擦系数
如果能创造条件，使Eq接近一个常数，则移动速率只与f即分子大小 有关，这样就能将蛋白质按分子大小不同进行分离。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
得到的粗提物，经离心 盐析、等电点沉淀、有机溶剂 沉淀 蛋白质粗产品
2.蛋白质的纯化
大小 纯化原理根据蛋白质具有不同的 溶解度
电荷
吸附性
3.蛋白质分离纯化的基本方法
1)根据分子大小不同的分离方法
透析法 离心沉降法 凝胶色谱法
透析法:根据分子量的大小，用透析袋将大、小分子
物质分开。
2.4.2
蛋白质的性质
1、蛋白质的两性解离和电泳现象
蛋白质与多肽一样，能够发生两性解离，也有等电点。 蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最 小，在电场中不向阳极也不向阴极移动。
在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。
在pH>pI溶液中,蛋白质粒子带负电荷,在电场中向正极移动;
米伦反应
• 米伦试剂：硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物 • 蛋白质溶液加入米伦试剂即产生白色沉淀，加热后沉淀 变红色。 • 酚类化合物、酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质有此反应。
酚试剂反应
• 酪氨酸中的酚基能将酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝 色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物） • 由于蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，所以可用此反应测 定蛋白质含量
，故样品 即是。 色的物质， 色的物质。
• 3、镰刀状贫血症是最早认识的一种分子病，患者的血 红蛋白分子亚基的第六位 氨酸被 氨酸所 替代，前一种氨基酸为 性侧链氨基酸，后者 为 性侧链氨基酸，这种微小的差异导致血 红蛋白分子在氧分压较低时易于聚集，氧合能力下降， 而易引起溶血性贫血。
离心沉降法
先加入适当的沉淀剂，将蛋白质溶液转成悬浮液，在不 同的离心速度下，使不同大小和密度的蛋白颗粒分离。 高速离心机（50000rpm/min以下） 超速离心机（60000rpm/min以上）
凝胶色谱法
2)利用溶解度不同的分离方法
等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
2.4.4
• • • •
几种重要的蛋白质类型
蛋白质是生命活动的体现， 依据形状可分为纤维蛋白和球形蛋白； 依据组成可分为简单蛋白和结合蛋白； 依据功能可分为催化剂蛋白、结构蛋白、参与生理活动蛋 白、储存氨基酸蛋白、 氧化供能蛋白等。
纤维状蛋白:角蛋白、丝蛋白 球状蛋白：血红蛋白、抗体
1.纤维状蛋白
坂口反应
• 精氨酸分子中的胍基能与次氯酸钠及α萘酚在氢氧化钠溶 液中产生红色产物 • 此反应可用来鉴定含有精氨酸的蛋白质 • 也可定量测定精氨酸的含量